These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
في الدعامات عودة التضيق يقدم من المضاعفات الرئيسية لإجراءات إعادة التوعي القائم على الدعامات المستخدمة على نطاق واسع لإعادة تدفق الدم من خلال قطاعات ضاقت حاد في الشرايين التاجية والطرفية. الدعامات اللف قادرة على إطلاق الانضباطي الجينات مع النشاط المضاد للrestenotic قد يقدم استراتيجية بديلة لاستخدامها في الوقت الحاضر يبلغ حجمه الدعامات المخدرات. من أجل تحقيق الترجمة السريرية، ويجب أن يبلغ حجمه الدعامات الجينات تظهر حركية يمكن التنبؤ بها، يجمد الدعامة الجين إطلاق النواقل والتنبيغ في مواقع محددة من الأوعية الدموية، مع تجنب الاستجابة الالتهابية المفرطة التي ترتبط عادة مع طلاء البوليمر المستخدمة في فخ المادي للناقلات. وتصف هذه الورقة منهجية مفصلة لcoatless الربط ناقلات الجينات الفيروسة الغدانية إلى الدعامات على أساس ملزمة عكسها من الجسيمات الفيروسة الغدانية إلى polyallylamine البايفوسفونيت (PABT) -modified المقاوم للصدأ السطح الصلب عبر المتحللة-linkers عبر (HC). عائلة مناستخدمت bifunctional (amine- وثيول رد الفعل) HC بمتوسط ر 1/2 من استر المائي في سلسلة تتراوح بين 5 و 50 أيام لربط النواقل مع الدعامات. وعادة ما يتم تنفيذ الإجراء ناقلات الشلل في غضون 9 ساعة، ويتكون من عدة خطوات: 1) حضانة العينات المعدنية في محلول مائي من PABT (4 ساعة). 2) deprotection الجماعات ثيول المثبتة في PABT مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (20 دقيقة). 3) التوسع في القدرة على رد الفعل ثيول من سطح المعدن عن طريق تفاعل مع العينات polyethyleneimine derivatized مع pyridyldithio (PDT) مجموعات (2 ساعة). 4) تحويل مجموعات PDT إلى التجولات مع dithiothreitol (10 دقيقة). 5) تعديل الفيروسات الغدية مع HC (1 ساعة). 6) تنقية جزيئات الفيروسة الغدانية تعديلها من قبل الحجم استبعاد العمود اللوني (15 دقيقة) و 7) من تجميد الجسيمات ثيول رد الفعل الفيروسة الغدانية على السطح الصلب thiolated (1 ساعة). هذا الأسلوب له تطبيق واسع محتمل خارج الدعامات،من خلال تسهيل الهندسة سطح الأجهزة bioprosthetic لتعزيز توافق مع الحياة من خلال توصيل الجينات بوساطة الركيزة للخلايا تفاعل المواد الأجنبية مزروع.
ويعوق فعالية العلاج الجيني كطريقة علاجية بواسطة القدرة استهداف الفقراء من ناقلات العلاج الجيني 1،2. عدم وجود نتائج الاستهداف المناسبة في مستويات فرعية علاجية من التعبير التحوير في الموقع المستهدف ويؤدي إلى نشر واسعة من ناقلات إلى أجهزة غير المستهدفة 3، بما في ذلك المسؤولين عن تصاعد الاستجابات المناعية ضد كل من ناقلات والمنتجات العلاجية المشفرة 4، 5. واحد يعني إمكانية للتعويض عن الاختلاط تنبيغ وتعزيز الاستهداف هو إدخال ناقلات الجينات في الموقع المطلوب في شكل يحول دون نشرها مجانا عبر الدم واللمف. عادة، وتعتمد هذه الجهود على أنظمة تسليم عن طريق الحقن إما محليا تتألف من ناقلات فيروسية أو غير الفيروسية ممزوجة مع الليفين، والكولاجين أو حمض الهيالورونيك هيدروجيل المصفوفات 6-10 القادرة على الحفاظ عابر ناقلات الجينات في موقع الحقن بواسطة entrapping جسديا عشرم في شبكة البوليمرية.
آخر نموذج المقبولة عموما للعلاج بالجينات محلية يستخدم تجميد ناقلات الجينات على سطح الأجهزة التعويضية مزروع 11،12. وتستخدم يزرع الطبية الدائمة (اللف، الشعب الهوائية، الدعامات المسالك البولية والجهاز الهضمي، وأجهزة ضبط نبضات القلب والمفاصل الاصطناعية، تنسجم الجراحية وأمراض النساء، الخ.) سنويا في عشرات الملايين من المرضى 13. في حين فعالة بشكل عام، وهذه الأجهزة عرضة للمضاعفات التي تسيطر عليها كافية الممارسات الطبية الحالية 14-17. زرع الأجهزة التعويضية فرصة فريدة لتكون بمثابة وكيل لمنصات العلاج الموضعي العلاج الجيني. من وجهة نظر الدوائية، اشتقاق سطح يزرع الطبية بجرعات منخفضة نسبيا من إدخال النتائج ناقلات الجينات في تحقيق كل من تركيزات عالية من المحلية ناقلات الجينات على الزرع / واجهة الأنسجة وتباطؤ حركية رغبتهمالقضاء ص من هذا الموقع. نتيجة لإقامة مطولة وتعزيز امتصاص من قبل السكان الخلية المستهدفة، ناقلات تجميد يقلل من انتشار ناقلات الجينات. وبالتالي يتم تقليل التلقيح غير مقصود من الأنسجة غير المستهدفة.
وقد تم تنفيذ الربط سطح ناقلات الجينات على المواد الحيوية القابلة للزرع (وهو ما يسمى أيضا باسم بوساطة الركيزة توصيل الجينات أو المرحلة الصلبة توصيل الجينات) في خلية ثقافة والحيوانية التجارب باستخدام كل محددة (ضد مستضد 18-20، 21،22، أفيدين البيوتين) و23-26 (تهمة، فان دير فال) التفاعلات غير محددة. المرفق التساهمية من ناقلات على سطح الجهاز مزروع وقد اعتبرت سابقا غير وظيفية منذ روابط قوية بشكل مفرط مع السطح تحول دون استيعاب ناقلات بواسطة الخلايا المستهدفة. مؤخرا وقد تبين أن هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال استخدام المتحللة بشكل عفوي عبر رابط تستخدم تيتراتبها بين السطح المعدني معدلة من الدعامات والبروتينات قفيصة من ناقلات الفيروسة الغدانية 27،28. وعلاوة على ذلك، فإن معدل إطلاق النواقل ودوام التعبير التحوير في المختبر وفي الجسم الحي يمكن التضمين مع استخدام المتحللة linkers عبر اظهار حركية مختلفة من التحلل 28.
وتقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة للمرفق التساهمية عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية لتنشيط سطح معدني ويدخل في الإعداد التجريبية مفيدة لدراسة الأحداث التي تلت ذلك التنبيغ في المختبر في العضلات الملساء والخلايا البطانية مثقف والحية في نموذج الفئران من السباتي الدعامات قسطرة .
يصف بروتوكول المعروضة طريقة التشغيلي للالركيزة بوساطة توصيل الجينات التي تحققت من خلال مرفق عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية إلى coatless أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ. بينما وضعت لغرض معين من العلاج الجيني القائم على دعامات من عودة التضيق الوعائي، هذه التقنية لها تط…
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have competing financial interests to disclose.
316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
Cephazolin | Apotex | not available | |
Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
PTA catheter | NuMed | custom order | |
Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
Saline | Baxter | 281321 | |
10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |