Gefäß Gentransfer von metallischen Stent Oberflächen mit Adenovirus-Vektoren durch Tethered Hydrolysierbare Vernetzer
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
In-Stent-Restenose stellt eine wesentliche Komplikation der Stentbasis Revaskularisierungsverfahren weithin verwendet, um die Wiederherstellung des Blutflusses durch kritisch verengter Segmente der koronaren und peripheren Arterien. Endovaskulären Stents in der Lage, abstimmbaren Freisetzung von Genen, die mit Anti-Restenose-Aktivität kann eine alternative Strategie präsentieren, um derzeit verwendeten Medikamenten-freisetzenden Stents. Um klinische Umsetzung zu erreichen, müssen Gen-freisetzenden Stents vorhersehbar Kinetik der Stent-immobilisiert Genvektor Mitteilung und ortsspezifische Transduktion von Gefäßsystem aufweisen, während eine übermäßige Entzündungsreaktion in der Regel mit den Polymerbeschichtungen für physikalischen Einschluß des verwendeten Vektors verbunden. Dieser Beitrag beschreibt eine detaillierte Methode, ohne Mantel Tethering adenoviraler Genvektoren, Stents basierend auf einer reversiblen Bindung der adenoviralen Partikel Polyallylamin Bisphosphonat (PABT) modifizierte Edelstahl-Oberfläche über hydrolysierbarer Vernetzer (HC). Eine Familie vonbifunktionelle (Amin-und Thiol-reaktive) HC mit einer durchschnittlichen t 1/2 der in der Kette Esterhydrolyse im Bereich zwischen 5 und 50 Tage waren verwendet, um den Vektor mit dem Stent zu verbinden. Der Vektor Immobilisierungsverfahren wird typischerweise innerhalb von 9 h durchgeführt und besteht aus mehreren Schritten: 1) Inkubation der Metallproben in einer wässrigen Lösung von PABT (4 h); 2) Entschützen von Thiolgruppen in PABT mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin (20 min) installiert ist; 3) Expansion von Thiol reaktiven Leistung von der Metalloberfläche durch Reaktion der Proben mit Polyethylenimin mit pyridyldithio (PDT) Gruppen (2 h) derivatisiert; 4) Umsetzung von PDT Gruppen Thiole mit Dithiothreitol (10 min); 5) Änderung von Adenoviren mit HC (1 Stunde); 6) Reinigung von modifizierten adenoviralen Partikel durch Größenausschluss-Säulenchromatographie (15 min) und 7) Immobilisierung von Thiol-reaktiven adenoviralen Partikel auf dem thiolierten Stahlfläche (1 h). Diese Technik hat breite potentielle Anwendbarkeit über Stents,durch die Erleichterung der Oberflächentechnik bioprothetischer Geräte ihrer Biokompatibilität durch das Substrat-vermittelte Gen-Lieferung an den Zellen Anbindung des implantierten Fremdmaterials zu verbessern.
Introduction
Die Wirksamkeit der Gentherapie als ein therapeutisches Mittel wird durch die schlechte Zielkapazität von Gentherapievektoren 1,2 behindert. Der Mangel an geeigneten Ziel Ergebnisse zu sub-therapeutischen Ebenen der Expression des Transgens am Zielort und führt zu einer weiten Verbreitung von Vektoren für Nichtzielorgane 3, auch die für die Montage Immunantwort sowohl gegen den Vektor und codiert therapeutisches Produkt verantwortlich 4, 5. Eine mögliche Mittel, um die Promiskuität der Transduktion Offset und zur Förderung der Ausrichtung ist es, Gen-Vektoren an der gewünschten Stelle in einer Form, die ihre freie Verbreitung über Blut und Lymphe schließt einzuführen. Typischerweise auf einem lokal injizierbares Abgabesysteme mit entweder viralen oder nicht-viralen Vektoren mit Fibrin, Kollagen oder Hyaluronsäure Hydrogelmatrices 6-10, die durch physikalisches Einschließen th fähig vorübergehend erhalt Genvektoren an der Injektionsstelle zugemischt verlassen diese Bemühungenem in einem polymeren Netzwerk.
Ein weiteres allgemein akzeptierte Paradigma für lokalisierte Gentherapie verwendet Immobilisierung von Genvektoren auf der Oberfläche der implantierten Prothesen 11,12. Dauerhafte medizinische Implantate (endovaskuläre, Bronchial-, urologische und Magen-Darm-Stents, Herzschrittmacher, künstliche Gelenke, chirurgische und gynäkologische Maschen, etc.) Werden jährlich in Millionen von Patienten 13 verwendet. Während sie im Allgemeinen wirksam sind diese Geräte anfällig für Komplikationen, die unzureichend für die durch Strom Arztpraxen 14-17 gesteuert werden. Implantierbaren Prothesen bieten eine einzigartige Gelegenheit, als Proxy-Plattformen für die lokale Gentherapie Behandlung dienen. Von der pharmakokinetischen Sicht Oberflächenderivatisierung von medizinischen Implantaten mit relativ niedrigen Eingangs Dosen von Genvektoren Ergebnisse bei der Erreichung sowohl hohe lokale Konzentrationen von Genvektoren auf das Implantat / Gewebe-Grenzfläche und eine Verlangsamung der Kinetik der their Elimination aus diesem Ort. Als Folge längerer Verweilzeit und verbesserte Aufnahme durch die Zielzellpopulation, Immobilisierung Vektor minimiert Ausbreitung der Gen-Vektor. Damit die unbeabsichtigte Inokulation von Nicht-Zielgeweben verringert.
Oberfläche Anbindehaltung von Genvektoren auf implantierbare Biomaterialien (auch als Substrat-vermittelte Gen Lieferung oder Festphasengentransfer bezeichnet) hat in der Zellkultur und Tierversuchen mit implementiert sowohl spezifische (Antigen-Antikörper 18-20, Avidin-Biotin 21,22) und nicht-spezifischen 23-26 (Ladung, van-der-Waals) Wechselwirkungen. Die kovalente Bindung von Vektoren an die Oberfläche der implantierten Vorrichtung zuvor als nicht-funktionell betrachtet worden, da zu starke Bindungen mit der Oberfläche entgegen Vektor Internalisierung durch die Zielzellen. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Begrenzung kann durch die Verwendung von spontan hydrolysierbaren Vernetzer als Tet verwendet überwindenihr zwischen dem modifizierten Metalloberfläche des Stents und Kapsidproteine des adenoviralen Vektors 27,28. Darüber hinaus kann der Vektor Freisetzungsrate und Zeitverlauf der Expression des Transgens in vitro und in vivo unter Verwendung von hydrolysierbaren Vernetzern, die unterschiedliche Kinetik der Hydrolyse 28 moduliert werden.
Die vorliegende Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll für die reversible kovalente Bindung von adenoviralen Vektoren an aktivierte Metalloberfläche und stellt eine nützliche experimentellen Aufbau zur Untersuchung der folgenden Ereignisse Transduktion in vitro kultivierten glatten Muskelzellen und Endothelzellen und in vivo in der Rattenhalsschlagmodell Stentangioplastie .
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine operative Methode zur Substrat vermittelt durch reversible Bindung von Adenovirus-Vektoren erreicht werden, um Oberflächen aus Edelstahl ohne Mantel Gen Lieferung. Während für den spezifischen Zweck der Stent-basierten Gentherapie von vaskulärer Restenose entwickelt hat diese Technik viel breitere Anwendungen auf den Gebieten der Biomaterialien, biomedizinische Implantate und Gentherapie.
Obwohl vorgestellten Studien wurden nur verwendet E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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