Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.
Her iki gen ifadesinin zamansal ve mekansal düzenleme hücre fonksiyonu üzerinde önemli sonuçları olabilir büyüyen gerçekleşme tek bir canlı hücrelerin içindeki bireysel RNA transkriptleri görselleştirmek için çeşitli tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Son zamanlarda tarif edilmiştir ümit verici bir teknik 3'-çevrilmemiş bölgesinde RBMB hedef dizinin en az dört tandem tekrarını ihtiva edecek şekilde, RNA transkriptlerini algılamak için bir oligonükleotid esaslı optik sonda, rasyometrik bimoleküler işaret fan (RBMB) kullanmaktadır. RBMBs tamamlayıcı RNA ile özel olarak melezleşme üzerine parlak bir flüoresan sinyal verecek şekilde tasarlanmış olan, ancak aksi takdirde söndürüldü kalır. Bu yaklaşımda, bir sentetik probunun kullanılması kırmızıya doğru kayar, ışığa karşı sağlar ve yüksek yayım organik boyalar görüntüleme için kullanılır. Bir geniş alan floresan mikroskop altında bakıldığı zaman farklı floresan noktalar işlenmiş olan RNA transkriptleri sonuçlar çok RBMBs bağlanması. Sonuç olarak, bireysel RNA transkript hareket hazır floresan görüntüleri bir zaman serisi alarak gerçek zamanlı olarak görülebilir. Burada mikroporasyonu hücrelere hazırlanması ve saflaştırılması RBMBs bölgesinin verilmesi tanımlanır ve canlı hücre tek RNA transkript görüntüleme.
RNA transkript ifadesi ve düzenlenmesi hücre davranışlarını ve kaderini kontrol etmek için büyük ölçüde sorumlu olan bir karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Dikte hücre fonksiyonunda RNA önemi bir süredir bilinmesine rağmen, bu iki en RNA analiz araçları gibi transkripsiyon ve çatlama gibi önemli düzenleyici bir etkinlik yakalamak için gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğü olmadığından, RNA arasında açık bir bağlantı çizmek zordur kaçakçılığı ve lokalize RNA işlenmesi. Bu, her RNA transkriptleri 1 gerçek zamanlı olarak canlı hücreler ile görselleştirilebilir olanak sağlayan çeşitli tekniklerin gelişmesiyle yol açmıştır. Belki de, bu tekniklerin en önemli 3'-UTR 2,3 MS2 olarak bağlanma alanının tandem tekrarını içeren işlenmiş olan RNA'yı hedef GFP MS2 füzyon proteinini kullanır. Yakın içine birden GFP molekülleri getirerek, bireysel RNA transkript gibi parlak floresan noktalar görünürfloresan mikroskobu ile. GFP-MS2 sistemi doğrudan görselleştirme ve transkripsiyon ölçümleri 4,5 patlama, benzersiz alt hücresel lokalizasyonu ve işleme 6-9 tespiti, ve RNA ulaşım 10 gerçek zamanlı görüntüleme, RNA davranış içine görülmemiş içgörü, sağlamıştır. Ancak, GFP-MS2 sisteminin muazzam potansiyele rağmen, bağlanmamış GFP-MS2 füzyon proteinleri bu tekniğin çok yönlülük ve dinamik aralığı sınırlar yüksek arka plan floresan sinyal oluşturabilir. Çeşitli yaklaşımlar subselüler bağlanmamış GFP-MS2 10 compartmentalization, protein fragmanı tamamlayamamakta 11, ve alternatif RNA bağlayıcı proteinler dahil, bu arka plan sinyali sınırlamak için geliştirilen ve 12 hedef oylandı. Ancak, bu yaklaşımların her RNA hedefinin ve GFP-MS2 füzyon proteinin nispi ifade toplam duyarlıdır.
Bir a olarakGFP-MS2 sistemlere lternative moleküler işaretçileri de 3'-UTR 13,14 tamamlayıcı bağlanma bölgesinin birbiri ardına dizilmiş tekrar mühendislikten RNA transkriptlerini algılamak için kullanılmıştır. Moleküler yol gösterici bir söndürücü ile bir ucunda ve bir flüoresan raportör diğer ucunda etiketlenmiştir saç tokası oluşturan oligonükleotid probları bulunmaktadır. RNA söndürücü flüoresan raportör hedef ve bağlı olmayan zaman düşük floresan hali ile sonuçlanarak, yakın kalır. Melezleme üzerine, floresan raportör ve söndürücü birbirinden ayrılır ve floresan restore edilmiştir. GFP-MS2 sistemi, floresan mikroskobu ile tespit edilebilir parlak florasan noktada bir tek RNA transkripti sonuçlar üzerine çok sayıda moleküler işaretçileri bağlanmasını benzer; Ancak, plan floresan nedeniyle bağlanmamış moleküler işaretlerinin söndürüldü yapılandırmasına, çok daha düşük olması beklenmektedir. Ne yazık ki, akıllı aktivasyon mekanizması rağmen bu m dahil edilirolecular işaret tasarımı, canlı hücre içine sokulduğunda bir saç tokası konformasyonunda kalmaz moleküler işaretleri melezleşmemiş giderek artan kanıtlar vardır. Sonuç olarak, belirgin bir sinyal-arka azaltan bir yanlış pozitif bir sinyal üretir. 15,16; Bu eksikliği gidermek için, biz son zamanlarda canlı hücreler, rasyometrik bimoleküler fenerler (Şekil 1A RBMBs) görüntüleme RNA için yeni bir sentetik sonda geliştirdi. RBMBs kısa saç tokası RNA (shRNA) ve moleküler işaretleri hem özelliklere sahip bir hibrid yapı oluşturan iki 2'-O-metil oligonükleotid şerit oluşur. 3'-UU çıkıntı ve uzun süreli etki, iki iplikçikli shRNA daha karakteristik ise döngü ve floresan aktivasyon mekanizması, moleküler işaret benzerdir. ShRNA özellikleri az gözlemlenebilir bozulması ile biz> 24 saat için yükseltmektedir içi ömür bulduk nükleer ihracat, sürücü tasarlanan vedöngüsünün spesifik olmayan açılmasını önler. Sonuç RBMBs moleküler işaretleri önemli ölçüde daha yüksek bir sinyal-arka plan gösterirler gibi.
RBMBs RNA esasına dayalı sondalar olarak aynı nükleer ihracat yetenekleri sahip olmayan DNA-temelli probları, çünkü DNA oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanabilir edilemez Belirtilmelidir. Yapısal olarak, RBMB köprüsü tipik olarak RNA, melezleşme üzerine özgüllük ve seçicilik arasında bir denge oluşturmak için, 15 ve 21, uzun bazlar arasında olması tasarlanmıştır. İki kendi kendini tamamlayan etki oluşturan kısa bir kök, genellikle 4 bazlar arasında olacak şekilde tasarlanmıştır. Daha uzun bir sap seçilirse, RBMB döngü ve hedef RNA ile hibritleşmenin hızı önemli ölçüde 17,18 yavaşlatılır. Daha kısa bir sap dizisi seçildiğinde Tersine, erime sıcaklığı, yüksek bir zemin sinyali yol açan, 37 ° C 'de sap-halka yapısını sürdürmek için çoğu zaman çok düşüktür. RBMB spesifikliği de kırmızısap uzunluğu olarak kısaltılır uced. Ayrıca RBMB performansını etkileyebilir RBMB kök döngüsünün dizisi için, dikkatle 19 seçilmelidir. Özellikle, doğru döngü diziler, en az bir ikincil yapı olması gereken minimum sekonder yapısı ile RNA sekansları ile hibridize olan, protein bağlama siteleri önlemek ve bağlanma hedef dışı kaçının. RBMB ve RNA ikincil yapısının her ikisinin tahminlerin mfold 20 gibi yazılımları kullanılarak elde edilebilir. Tamamlayıcı hedef dışı siteler bir nükleotid Temel Yerel Atama Arama Aracı (ŞOK) kullanılarak tespit edebilirsiniz. Ancak, model tahminleri ve protein-bekliyorumdur bölgelerinin tanımlanmasında zorluk tutarsızlıklar, tüm RBMBs özgüllüğü sonuçta deneysel doğrulanması gerekir.
Eğer arzu edilirse, hibridizasyon durumuna karşı duyarsız olan söndürülmemiş referans boya RBMB 15 eklenebilir. Referans boyanın eklenmesi için prsistemi teslimat için bir işaretleyici Ovide ve toplam hücresel floresans daha kesin olarak ölçülmesi gereken eğer oran ölçer görüntüleme için kullanılabilir. Referans boyalar ölçüm teslimat hücre-hücre değişiklikleri nedeniyle arka farklılıkların ayarlanmasını sağlar. Bununla birlikte, tek tek RNA görüntülerken, belirli referans boya gerekli değildir transkript. Özellikle, bazı referans boyalar çekirdeğinde biraz daha yüksek bir arka plan sinyali yol çekirdekten RBMBs ihracat engelleyebilir.
Doğru tasarlandığında hedef RNA en az dört RBMB bağlama sahası (Şekil 1B) 16 ihtiva edecek şekilde ise, RBMBs, tek bir canlı hücrelerde tek tek görüntü RNA transkriptleri için kullanılabilir. RBMBs verimli hücre canlılığı 21 az veya hiç etkisi ile mikroporasyonu yoluyla hücre türleri geniş bir aralığı içine teslim edilebilir, ve gen ifadesinin niceliksel ölçümler olabilir30 dakika içinde edinilmiş. Ilişkisiz RBMBs flüoresan verimli söndürülür Dahası, metodoloji, RBMB konsantrasyon ve hedef RNA düzeyleri oldukça duyarsızdır. Burada RBMBs hazırlamak ve saflaştırmak için kullanılan metodolojinin detaylı açıklamasını, yanı sıra mikroporasyonu üzerinden canlı-hücre içine RBMBs teslimat için genel bir prosedür ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkript görüntüleme sağlamak.
Bilinen bir geniş alan mikroskop kullanılarak canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri yeteneği, her bir RNA transkripti ve bağlanmayan flüoresan kaynaklanan düşük bir floresan arka plan ile ilişkili bir parlak ve ışığa karşı kararlı floresan sinyali gerektirmektedir. Bu yöntemde, parlak bir flüoresan sinyal, her bir RNA transkripti üzerine (96 kadar) birden fazla oligonükleotid bazlı flöresanlı sondalar örneğin, RBMBs hibritleme ile elde edilir. Bununla birli…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı KARİYER Ödülü (0953583) ve Sağlık NCI / R21-CA116102 Ulusal Enstitüsü NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 tarafından desteklenmiştir.
Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
SOLA light engine | Lumencor | ||
Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |