משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.
ההבנה הגוברת ששתי הרגולציה של הזמן ומרחב של ביטוי גנים יכולה להיות השלכות חשובות על תפקוד תאים הובילה לפיתוחן של טכניקות מגוונות לדמיין תעתיקי רנ"א פרט בתאי חיים בודדים. טכניקה מבטיחה אחת לאחרונה כי תוארה מנצלת בדיקה מבוססת oligonucleotide אופטי, ratiometric משואת bimolecular (RBMB), כדי לזהות מולקולות RNA שהונדסו כדי להכיל לפחות ארבעה חוזרים טנדם של רצף יעד RBMB באזור 3'-מתורגם. RBMBs נועד במיוחד כדי לפלוט אות ניאון בוהקת על הכלאה לRNA המשלים, אבל חוץ מזה נשאר הרווה. השימוש בבדיקה סינתטית בגישה זו מאפשרת photostable, אדום העביר, וצבעים אורגניים emissive מאוד לשמש הדמיה. כריכה של RBMBs מרובה לתוצאות תעתיקי רנ"א המהונדסים במקומות דיסקרטיים הקרינה כאשר מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום. כתוצאה מכך, התנועה של מולקולות RNA בודדות יכולה להיות דמיין בקלות בזמן אמת על ידי לקיחת סדרת זמן של תמונות ניאון. כאן אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, משלוח לתאים על ידי microporation ולחיות תאי הדמיה של מולקולות RNA בודדות.
הביטוי והרגולציה של מולקולות RNA הוא תהליך מורכב ודינמי שהוא אחראי במידה רבה לשליטה בהתנהגות תא וגורל. למרות חשיבותו של RNA בתפקוד תא מכתיב כבר ידועה לכמה זמן, הוא לעתים קרובות קשה לצייר קשרים ברורים בין השניים שכן רוב כלי ניתוח RNA חסרי הרזולוציה המרחב ובזמן הנדרשת כדי ללכוד אירועי רגולציה חשובים כגון התפוצצות שעתוק, RNA סחר, ועיבוד RNA מקומי. זה הוביל להופעתו של מספר טכניקות שתאפשרנה תעתיקי רנ"א בודדים להיות דמיינו בתאים חיים בזמן אמת 1. אולי, הבולט ביותר של טכניקות אלה מנצל חלבון היתוך GFP-MS2 למקד RNA שתוכנן כדי להכיל חוזר טנדם של האתר מחייב MS2 ב3'-UTR 2,3. על ידי הבאת מולקולות GFP מרובות לתוך סמיכות, תעתיקי רנ"א בודדים מופיעים כתמים בהירים כמו ניאוןבאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מערכת GFP-MS2 סיפקה תובנה חסרת תקדים לתוך RNA התנהגות, כוללים הדמיה ישירה ומדידות של תעתיק מתפוצצת 4,5, זיהוי של לוקליזציה משנה הסלולר ייחודית ועיבוד 6-9, והדמיה של רנ"א תחבורה 10 בזמן אמת. עם זאת, למרות הפוטנציאל העצום של מערכת GFP-MS2, חלבוני היתוך GFP-MS2 מאוגדים יכולים ליצור אות ניאון גבוה רקע שמגבילה את הגמישות וטווח דינמי של טכניקה זו. מספר גישות פותחו כדי להגביל את אות רקע זה, לרבות מידור subcellular של GFP-MS2 מאוגד 10, שלמת בר חלבון 11, וחלבוני RNA מחייב חלופיים ומטרות 12. עם זאת, כל הגישות הללו יישארו רגישים לביטוי היחסי ומוחלט של יעד RNA וחלבון היתוך GFP-MS2.
כlternative למערכות GFP-MS2, משואות מולקולריות יש גם משמשות לאיתור תעתיקי רנ"א מהונדס עם חוזר טנדם של האתר הקישור משלים ב3'-UTR 13,14. משואות מולקולריות הן בדיקות oligonucleotide יוצרי סיכת ראש שמסומנות בקצה אחד עם מרווה ובקצה השני עם כתב ניאון. כאשר אינו מחויבים למקד RNA כתב הניאון ומרווה להישאר בסמיכות, וכתוצאה מכך מדינה נמוכה ניאון. על הכלאה, הכתב ומרווית הניאון נאלצים לגזרים והקרינה משוחזרת. בדומה למערכת GFP-MS2, את הכריכה של משואות מולקולריות מרובות על תוצאות תעתיקי הרנ"א יחידים במיקום ניאון בהיר שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי; עם זאת, הקרינה הרקע צפויה להיות נמוכים בהרבה, בשל התצורה הרווה של משואות מולקולריות מאוגדים. למרבה הצער, למרות מנגנון ההפעלה המתוחכם שהוא שולב מ 'עיצוב משואת olecular, עכשיו יש ראיות הולכות ומצטברות כי unhybridized משואות מולקולריות לא נשאר בקונפורמציה סיכת הראש בעת שהוכנס לתאים חיים. כתוצאה מכך, הם מייצרים אות חיובית שגויה שמפחיתה את האות לרקע באופן משמעותי. כדי להתגבר על חסרון זה, לאחרונה פיתח בדיקה סינתטית חדשה לRNA הדמיה בתאים חיים, משואות bimolecular ratiometric (RBMBs; איור 1 א) 15,16. RBMBs מורכב משני גדילי oligonucleotide 2'-O-מתיל היוצרים מבנה היברידי עם תכונות משני RNA הקצר סיכת הראש (shRNA) ומשואות מולקולריות. מנגנון הלולאה והפעלת הקרינה דומה למגדלור המולקולרי, ואילו תחום פעמיים התקועות הארוך עם הסככה 3'-UU הוא יותר אופייני לshRNA. תכונות shRNA נועדו להסיע את היצוא גרעיני, שבו אנו מוצאים עליות חיים תאיים ל> 24 שעות, עם השפלה נצפית מינימאלית, ומונע פתיחה הלא ספציפית של הלולאה. כתוצאת RBMBs תערוכת רקע אות לגבוה יותר באופן משמעותי ממשואות מולקולריות.
יש לציין כי RBMBs לא יכול להיות מוכן באמצעות oligonucleotides DNA, מאז בדיקות מבוססות DNA לא להחזיק את אותן יכולות יצוא גרעיניות כמו בדיקות מבוססות RNA. מבחינה מבנית, RBMB הלולאה נועדה בדרך כלל להיות בין 15 ו21 בסיסים ארוכים, כדי ליצור איזון בין הספציפיות וסלקטיביות על הכלאת RNA. הגבעול הקצר שיוצר מהתחומים שני עצמי משלים בדרך כלל נועד להיות 4 בסיסים. אם גזע כבר נבחר, השיעור של הכלאה בין לולאת RBMB וRNA היעד מואט באופן משמעותי 17,18. לעומת זאת, כאשר רצף גזע קצר יותר נבחר טמפרטורת ההתכה היא לעתים קרובות נמוכה מדי כדי לקיים את מבנה גזע הלולאה על 37 מעלות צלזיוס, מה שמוביל לאות רקע גבוהה. את הספציפיות של RBMB היא גם אדומותuced כאורך הגזע מתקצר. מאז הרצף של גזע הלולאה RBMB גם יכול להשפיע על תפקוד RBMB, זה חייב להיות שנבחר בקפידה 19. בפרט, צריכים להיות רצפי לולאה אידיאליים מבנה המשני מינימאלי, להכליא רצפי הרנ"א עם מבנה משני מינימאלי, להימנע מאתרי קישור של חלבון, ולהימנע מחוץ יעד מחייב. ניתן להשיג את תחזיות של שני RBMB ומבנה משני RNA באמצעות תוכנה כגון mfold 20. משלימים אתרים מחוץ היעד יכולים זוהו באמצעות כלי נוקלאוטיד יסוד מקומי חיפוש הקצאה (תפציץ). עם זאת, בשל חוסר עקביות בתחזיות מודל ואת הקושי בזיהוי אתרי מכבדי חלבון, את הספציפיות של כל RBMBs חייבות סופו של דבר להיות מאומתות בניסוי.
אם רצוי, צבע התייחסות unquenched שאינו רגיש למדינת ההכלאה ניתן להוסיף לRBMB 15. התוספת של צבע התייחסות יכולה יחסי הציבורovide סמן למסירת בדיקה ולשמש הדמיה ratiometric, אם מדידות מדויקות יותר של הקרינה סלולרית בסך הכל נדרשות. צבעי ההתייחסות מאפשר מדידות להיות מותאמות להבדלים ברקע בשל וריאציות תא אל התא במשלוח. עם זאת, כאשר ההדמיה RNA הבודד תמלילי צבע ההתייחסות הוא לא הכרחי. יש לציין, צבעים מסוימים התייחסות יכולים להפריע ליצוא של RBMBs מהגרעין, שהוביל לאות רקע מעט גבוהה יותר בגרעין.
כאשר מתוכנן כראוי, יכול לשמש RBMBs לתעתיקי רנ"א הבודד תמונה בתאי חיים בודדים, אם RNA היעד מתוכנן להכיל לפחות ארבעה אתרי RBMB מחייבים (איור 1 ב) 16. RBMBs יכול להיות מועבר בצורה יעילה למגוון רחב של סוגי תאים באמצעות microporation, עם לא מעט השפעה על תא כדאיות 21, ומדידות כמותיות של ביטוי גנים יכולות להיותרכש בתוך 30 דקות. יתר על כן, המתודולוגיה היא די רגישה לרמות ריכוז RBMB וRNA היעד, שכן הקרינה מRBMBs מאוגד הוא הרווה ביעילות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת להכנה ולטהר RBMBs, כמו גם נוהל כללי לאספקת RBMBs לחית תאים באמצעות microporation וההדמיה של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.
יכולת תמלילים יחידים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי דורשת אות ניאון בהירה וphotostable להיות מזוהה עם כל תעתיקי הרנ"א ורקע ניאון נמוך הנובע מבדיקות ניאון מאוגדים. בשיטה זו, אות ניאון בהירה מושגת על ידי הכלאה מרובה (עד 96) בדיקות ניאון מב…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על קרן מדע קריירת הפרס הלאומי (0953583) והמכון הלאומי לבריאות NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 על ידי.
Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
SOLA light engine | Lumencor | ||
Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |