Логометрический бимолекулярные маяки (RBMBs) могут быть использованы для изображения отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка RBMBs в клетки microporation и флуоресцентных изображений одиночных транскриптов РНК в режиме реального времени.
Растущее осознание того, что как временной и пространственной регуляции экспрессии генов может иметь серьезные последствия на функции клеток привело к разработке различных методов визуализации отдельных транскриптов РНК в отдельных живых клеток. Одним из перспективных методов, который недавно был описан использует олигонуклеотидную основе оптического зонда, пропорциональный бимолекулярная маяк (RBMB), для обнаружения РНК-транскриптов, которые были инженерии, чтобы содержать по меньшей мере четыре тандемных повторов RBMB последовательности-мишени в 3'-нетранслируемой области. RBMBs специально разработаны для излучают яркий флуоресцентный сигнал при гибридизации к комплементарной РНК, но в остальном остаются угасает. Использование синтетического зонда в Такой подход позволяет фотостабилен, красное смещение, и очень эмиссионные органические красители, которые будут использоваться для работы с изображениями. Связывание нескольких RBMBs в инженерных РНК-транскриптов результатов в дискретных точках флуоресценции, если смотреть под широким полем флуоресцентного микроскопа. Следовательно, движение отдельных транскриптов РНК могут быть легко визуализированы в реальном времени с помощью принятия временной ряд флуоресцентных изображений. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка в клетки по microporation и жить-ячейки изображения отдельных транскриптов РНК.
Выражение и регулирование РНК-транскриптов является сложным и динамичным процессом, в значительной степени отвечает за контроль на поведение клеток и судьбу. Хотя важность РНК в диктующей функции клеток была известна в течение некоторого времени, часто бывает трудно провести четкую связь между двумя, так как большинство инструментов анализа РНК хватает пространственное и временное разрешение, необходимое для захвата важных нормативных мероприятий, таких как транскрипции лопнул, РНК торговля, и локализованная обработка РНК. Это привело к появлению нескольких методов, которые позволяют отдельные транскрипты РНК, чтобы быть визуализированы в живых клетках в реальном времени 1. Пожалуй, самый известный из этих методов использует GFP-MS2 слитый белок, чтобы РНК-мишени, которая была разработана специально для содержат тандемные повторы сайта связывания MS2 в 3'-UTR 2,3. Собрав несколько молекул GFP в непосредственной близости, отдельные стенограммы РНК отображаться в виде ярких флуоресцентных пятенчерез флуоресцентной микроскопии. Система GFP-MS2 предоставил беспрецедентную понимание поведения РНК, в том числе прямой визуализации и измерения транскрипции разрыва 4,5, обнаружения уникальной субклеточном локализации и обработки 6-9 и в режиме реального времени визуализации РНК транспорта 10. Однако, несмотря на огромный потенциал системы GFP-MS2, несвязанные белки слияния GFP-MS2 может создать высокий фоновый флуоресцентный сигнал, который ограничивает универсальность и динамический диапазон этой техники. Несколько подходов были разработаны для ограничения этого фонового сигнала, в том числе субклеточной компартментализации несвязанного GFP-MS2 10, дополнения фрагмента белка 11 и альтернативных РНК связывающих белков и цели 12. Тем не менее, все эти подходы остаются чувствительными к относительной и общей экспрессии РНК-мишени и GFP-MS2 слитого белка.
В качестве аlternative к системам GFP-MS2, молекулярные маяки были также использованы для обнаружения инженерии РНК-транскрипты с тандемных повторов дополнительного сайта связывания в 3'-UTR 13,14. Молекулярные маяки шпильки формирования олигонуклеотидные зонды, которые помечены на одном конце с гасителем и на другом конце с флуоресцентным репортером. Когда не связан с РНК-мишени флуоресцентного репортера и гасителем оставаться в непосредственной близости, что приводит к низкой флуоресцентного состояния. После гибридизации, флуоресцентный репортер и утоления вынуждены друг от друга и флуоресценции восстанавливается. Как и в GFP-MS2 системы, связывание нескольких молекулярных маяков на одном результаты РНК-транскрипта в светлом месте флуоресцентного который может быть идентифицирован с помощью флуоресцентной микроскопии; Тем не менее, фон флуоресценции как ожидается, будет значительно ниже, за счет закаленного конфигурации несвязанных молекул маяков. К сожалению, несмотря на умной механизма активизации, который включен в мolecular дизайн маяк, в настоящее время все больше доказательств, что негибридизированным молекулярные маячки не остаются в шпильки конформации при введении в живые клетки. Следовательно, они создают ложное-положительных сигнал, что значительно снижает отношение сигнал-фон. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы недавно разработали новый синтетический зонд для визуализации РНК в живых клетках, логометрических бимолекулярные маяки (RBMBs; Рисунок 1A) 15,16. RBMBs состоят из двух 2'-О-метил олигонуклеотидных цепей, которые образуют гибридную структуру с признаками как короткий шпильки РНК (ShRNA) и молекулярных маяков. Механизм петли и активация флуоресценции похожа на молекулярном маяка, в то время как длинные двухцепочечную область с выступом 3'-UU более характерно ShRNA. Особенности ShRNA предназначены для привода ядерный экспорт, который мы нашли, повышает внутренние жизнь, чтобы> 24 ч, с минимальным поддавалось разрушению, ипредотвращает неспецифическую открытие цикла. В результате RBMBs демонстрируют значительно более высокий сигнал-фон, чем молекулярных маяков.
Следует отметить, что RBMBs не может быть получена с использованием ДНК-олигонуклеотидов, так как ДНК-зондов на основе не обладают теми же ядерный потенциал Экспорт в РНК-зондов на основе. Конструктивно RBMB цикл, как правило, предназначены для между 15 и 21 баз длительного, чтобы создать баланс между специфичности и селективности при РНК гибридизации. Короткий стержень, который формирует из двух самодополнительных доменов обычно предназначен для 4 основания. Если выбран больший стебель, скорость гибридизации между RBMB петли и РНК-мишени значительно замедлился 17,18. С другой стороны, когда выбран более короткий стержень последовательность температура плавления часто слишком низким, чтобы поддерживать структуру стволовых петли при 37 ° С, что приводит к высокой фонового сигнала. Специфика RBMB также красныйuced как длина штока сокращается. Поскольку последовательности RBMB стволовых петли также может влиять производительность RBMB, она должна быть тщательно отобраны 19. В частности, последовательности идеальные петли должны иметь минимальную вторичную структуру, гибридизации с РНК последовательностей с минимальным вторичной структуры, избежать белковые сайты связывания, и избежать мимо цели связывания. Предсказания как RBMB и вторичной структуры РНК могут быть получены с помощью программного обеспечения, таких как mfold 20. Дополнительные мимо ворот сайты могут идентифицировать с помощью нуклеотидной Basic Local Назначение Search Tool (BLAST). Однако из-за несоответствия в модельных предсказаний и трудности в выявлении белка-выжидать сайтов, специфика всех RBMBs должны в конечном счете быть подтверждено экспериментально.
Если желательно, незамороженный ссылки краситель, который нечувствителен к состоянию гибридизации могут быть добавлены к RBMB 15. Добавление эталонного красителя может прOvide маркер для доставки зонда и использовать для радиометрического изображения, если требуются более точные измерения общего клеточного флуоресценции. Опорные красители позволяет выполнять измерения с поправкой на разницу в фоновом режиме благодаря клетки к клетке вариаций в комплект поставки. Тем не менее, при визуализации индивидуальный РНК-транскриптов ссылка на красителе не является необходимым. Примечательно, некоторые ссылки красители могут помешать экспорту RBMBs от ядра, что приводит к несколько более высоким фонового сигнала в ядре.
Когда разработана должным образом, RBMBs могут быть использованы для изображения индивидуальных РНК-транскриптов в отдельных живых клеток, если целевой РНК сконструирован так, чтобы содержать, по меньшей мере, четыре RBMB сайты связывания (рисунок 1b) 16. RBMBs может быть эффективно доставлен в широком диапазоне клеток типов через microporation, с практически не влияет на жизнеспособность 21 клеток, и количественные измерения экспрессии генов может бытьприобрела в течение 30 мин. Кроме того, методология довольно нечувствительна к концентрации RBMB и целевой РНК уровнях, так как флуоресценции от несвязанных RBMBs эффективно гасят. Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для подготовки и очистки RBMBs, а также общий порядок на поставку RBMBs в живых клеток через microporation и визуализацию отдельных транскриптов РНК в режиме реального времени.
Возможность изображений отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках с помощью обычного широкого поле микроскопа требуется яркое и фотостабилен флуоресцентный сигнал, связанный с каждым РНК-транскрипта и низкой флуоресцентного фона, исходящего из несвязанных флуоресцентн…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом КАРЬЕРА премии (0953583) и Национального института здравоохранения NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
SOLA light engine | Lumencor | ||
Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |