Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons
Summary
Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel.
Abstract
La prise de conscience croissante que le règlement de temporelle et spatiale de l'expression du gène peut avoir des conséquences importantes sur la fonction cellulaire a conduit au développement de diverses techniques de visualiser des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples. Une technique prometteuse qui vient d'être décrite utilise une sonde à base d'oligonucléotide-optique, ratiométrique balise bimoléculaire (RBMB), pour détecter des transcrits d'ARN qui ont été modifiées pour contenir au moins quatre répétitions en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la région 3 'non traduite. RBMBs sont spécifiquement conçus pour émettre un signal fluorescent lumineux par hybridation à l'ARN complémentaire, mais autrement, restent éteints. L'utilisation d'une sonde synthétique dans cette approche permet photostable, décalé vers le rouge, et des colorants organiques fortement émissifs à être utilisé pour l'imagerie. La liaison de plusieurs RBMBs les ARN transcrits les résultats d'ingénierie dans les points de fluorescence discrets lorsqu'on les examine sous un microscope à fluorescence à champ large. Par conséquent, le mouvement de transcrits d'ARN individuels peuvent être facilement visualisées en temps réel en prenant une série temporelle d'images fluorescentes. Nous décrivons ici la préparation et la purification de RBMBs, la livraison dans les cellules par microporation et vivons-cellule imagerie de transcrits d'ARN simple.
Introduction
L'expression et la régulation des transcrits d'ARN est un processus complexe et dynamique qui est en grande partie responsable de contrôler le comportement des cellules et sort. Bien que l'importance de l'ARN dans la fonction des cellules dicter est connue depuis un certain temps, il est souvent difficile d'établir des liens clairs entre les deux puisque la plupart des outils d'analyse de l'ARN n'ont pas la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer les événements réglementaires importants tels que la transcription éclatement, de l'ARN la traite, et le traitement de l'ARN localisée. Cela a conduit à l'apparition de plusieurs techniques qui permettent de transcription d'ARN différents à être visualisés dans des cellules vivantes en temps réel 1. Peut-être le plus important de ces techniques utilise une protéine de fusion GFP-MS2 à l'ARN cible qui a été modifié pour contenir des répétitions en tandem du site de liaison de MS2 dans la 3'-UTR de 2,3. En apportant de multiples molécules de GFP en proximité, transcrits d'ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes brillantespar microscopie de fluorescence. Le système GFP-MS2 a fourni un aperçu sans précédent sur le comportement de l'ARN, y compris la visualisation directe et mesures de transcription éclatement 4,5, la détection de la localisation et de la transformation 6-9 uniques sub-cellulaire et l'imagerie en temps réel du transport de l'ARN 10. Cependant, en dépit de l'énorme potentiel du système GFP-MS2, des protéines de fusion GFP-MS2 non liés peuvent créer un signal fluorescent de fond élevé qui limite la polyvalence et la gamme dynamique de cette technique. Plusieurs approches ont été développées pour limiter ce signal de fond, y compris le cloisonnement subcellulaire de la GFP-MS2 non lié 10, fragment de protéine complémentation 11, et des protéines de liaison d'ARN et d'autres cibles 12. Cependant, toutes ces approches restent sensibles à l'expression relative et totale de l'ARN cible et GFP-MS2 protéine de fusion.
A titre d'unLTERNATIVE aux systèmes GFP-MS2, les balises moléculaires ont également été utilisées pour détecter des transcrits d'ARN modifiées avec des répétitions en tandem du site de liaison complémentaire à l'extrémité 3 'UTR 13,14. Les balises moléculaires sont des sondes oligonucléotidiques formant épingle à cheveux qui sont marqués à une extrémité avec un agent d'extinction et à l'autre extrémité avec un rapporteur fluorescent. Quand il n'est pas lié à l'ARN cible le rapporteur fluorescent et un extincteur rester à proximité, ce qui entraîne un état de faible fluorescent. Lors de l'hybridation, le rapporteur fluorescent et extincteur sont écartées et la fluorescence est rétabli. Similaire au système GFP-MS2, la liaison de balises moléculaires multiples sur un seul résultat de la transcription de l'ARN dans un endroit lumineux fluorescent qui peut être identifiée par microscopie à fluorescence; cependant, la fluorescence de fond devrait être beaucoup plus faible, en raison de la configuration de trempe balises moléculaires non liés. Malheureusement, malgré le mécanisme d'activation intelligente qui est incorporé dans la mconception de balise olecular, il ya maintenant plus de preuves que non hybridée balises moléculaires ne restent pas dans la conformation en épingle à cheveux lorsqu'il est introduit dans des cellules vivantes. Par conséquent, ils génèrent un signal de faux-positifs, qui réduit de manière significative le rapport signal sur fond. Pour pallier cet inconvénient, nous avons récemment développé une nouvelle sonde de synthèse de l'ARN d'imagerie des cellules vivantes, balises bimoléculaires ratiométriques (RBMBs; Figure 1A) 15,16. RBMBs sont composées de deux brins d'oligonucléotides 2'-O-méthyle qui forment une structure hybride avec des caractéristiques à la fois de l'ARN court en épingle à cheveux (shRNA) et des balises moléculaires. Le mécanisme d'activation de la boucle et la fluorescence est similaire à la balise moléculaire, tandis que le long double brin domaine avec un surplomb en 3 'UU est plus caractéristique des shRNA. Les caractéristiques shRNA sont conçus pour conduire l'exportation nucléaire, que nous avons trouvé une augmentation vie intracellulaire de> 24 h, à la dégradation observable minimale, etempêche l'ouverture non-spécifique de la boucle. En conséquence RBMBs présentent un fond signal-significativement plus élevé que les balises moléculaires.
Il est à noter que RBMBs ne peut être préparé en utilisant des oligonucléotides d'ADN, puisque les sondes à base d'ADN ne possèdent pas les mêmes capacités d'exportation nucléaires que des sondes à base d'ARN. Structurellement, la boucle de RBMB est généralement conçue pour être comprise entre 15 et 21 bases de long, à créer un équilibre entre la spécificité et la sélectivité de l'hybridation sur l'ARN. La tige courte qui se forme à partir de deux domaines auto-complémentaires est généralement conçu pour être quatre bases. Si une tige plus longue est choisie, le taux d'hybridation entre la boucle de RBMB et l'ARN cible est significativement ralentie 17,18. A l'inverse, quand une séquence de tige plus courte est sélectionnée, la température de fusion est souvent trop faible pour maintenir la structure tige-boucle à 37 ° C, conduisant à un signal de fond élevé. La spécificité de la RBMB est également rougeuced que la longueur de la tige est raccourcie. Depuis la séquence de la tige-boucle de RBMB peut également influer sur les performances de RBMB, il doit être soigneusement sélectionné 19. En particulier, les séquences de boucle idéal devrait avoir une structure secondaire minimale, s'hybrider à des séquences d'ARN avec une structure secondaire minimale, d'éviter les sites de liaison de protéines, et éviter hors cible de liaison. Prédictions des deux RBMB et structure secondaire d'ARN peuvent être obtenues en utilisant un logiciel tel que mfold 20. Sites complémentaires hors-cible peuvent identifiés à l'aide d'un nucléotide base locale Affectation outil de recherche (BLAST). Cependant, en raison d'incohérences dans les prédictions du modèle et de la difficulté à identifier les sites de protéines Biding, la spécificité de tous les RBMBs doit finalement être validée expérimentalement.
Si on le souhaite, un colorant de référence non éteint qui est insensible à l'état d'hybridation peut être ajouté à la RBMB 15. L'addition d'un colorant de référence peut prOvide un marqueur pour la livraison de la sonde et être utilisés pour l'imagerie ratiométrique, si des mesures plus précises de fluorescence cellulaire total sont nécessaires. Les colorants de référence permet d'ajuster les mesures de différences de fond dues aux variations de cellule à cellule dans la livraison. Cependant, lors de l'imagerie de l'ARN transcrits colorant individuel de référence n'est pas nécessaire. Notamment, certains colorants de référence peuvent interférer avec l'exportation de RBMBs à partir du noyau, ce qui conduit à un signal d'arrière-plan légèrement plus élevée dans le noyau.
Lorsqu'ils sont bien conçus, RBMBs peuvent être utilisés pour l'image des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples, si l'ARN cible est conçue pour contenir au moins quatre sites de liaison de RBMB (figure 1B) 16. RBMBs peuvent être efficacement délivrés dans une large gamme de types de cellules par l'intermédiaire de microporation, avec peu ou pas d'effet sur la viabilité des cellules 21, et des mesures quantitatives de l'expression de gènes peuvent êtreacquis dans les 30 minutes. De plus, la méthode est assez peu sensible à des niveaux de concentration de RBMB et ARN cible, étant donné que la fluorescence de RBMBs non liés est efficacement stoppée. Ici, nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour préparer et purifier RBMBs, ainsi que d'un mode opératoire général pour la prestation de RBMBs en cellules vivantes par microporation et l'imagerie des transcrits d'ARN simples en temps réel.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité d'une seule image de transcription d'ARN dans des cellules vivantes modifiées à l'aide d'un microscope à champ large classique nécessite un signal lumineux fluorescent et photostable à être associée à chaque produit de transcription d'ARN et un faible bruit de fond de fluorescence émanant de sondes fluorescentes non liés. Dans ce procédé, un signal lumineux fluorescent est obtenu par hybridation multiple (jusqu'à 96) des sondes fluorescentes à base d'oligonucléotid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Prix National Science Foundation CARRIÈRE (0953583) et l'Institut national de la santé NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
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