Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica
Summary
Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.
Abstract
Los poxvirus son una familia de virus de ADN de doble cadena que incluyen patógenos humanos activos tales como viruela de los monos, molusco contagioso, y virus de Contagalo. La familia también incluye el virus de la viruela, de la viruela. Debido a la complejidad de la replicación del virus de la viruela, aún quedan muchas preguntas con respecto a su estrategia de la expresión génica. En este artículo se describe la conceptualización y el uso de los virus vaccinia recombinantes que permiten la medición en tiempo real de las etapas individuales y múltiples de la expresión génica viral en un formato de alto rendimiento. Esto es posible mediante el uso de proteínas fluorescentes espectralmente distintas como reporteros para cada una de tres etapas de la replicación viral. Estos virus ofrecen una alta relación señal-ruido al tiempo que conserva los patrones de expresión específicos de la etapa, los ensayos basados en la placa de habilitación y observaciones microscópicas de la propagación del virus y la replicación. Estas herramientas tienen usos para el descubrimiento antiviral, los estudios de la interacción virus-huésped, y la bio evolutivología.
Introduction
Tradicionalmente, la expresión del virus se estudia el uso de técnicas de biología molecular (por ejemplo, transferencia de Northern, Western Blot, microarrays de hibridación, etc) 1. Si bien estos métodos son capaces de proporcionar información detallada con respecto a los cambios de expresión de ARNm o proteínas individuales categorizar, por lo general no son susceptibles de procesos en tiempo real y de alto rendimiento. Los enfoques alternativos que utilizan los periodistas basados en fluorescencia se han aplicado anteriormente al trabajar con poxvirus; Sin embargo, su desarrollo y su uso ha sido motivado por diversos objetivos. Varios de tales métodos se diseñaron para la selección de virus recombinantes 2,3. Estas técnicas expresan EGFP después de la incorporación y expresión del ADN exógeno a partir de clones de vaccinia recombinantes adecuada. Del mismo modo, varias cepas de vaccinia que expresan establemente EGFP solubles o proteínas GFP-etiquetados expresadas bajo un promotor de vaccinia nativo han sido ampliamente utilizados. Estos son typcamente utiliza para cuantificar la entrada del virus y la replicación durante los ensayos de neutralización a base de anticuerpos, inhibición química, o la comparación de la eficacia antiviral 4-6. Si bien estos virus han demostrado ser útiles, están limitados en su capacidad para proporcionar información detallada sobre el punto de inhibición debido a su uso de un único promotor viral temprano / tardío ambigua. Los métodos anteriores también han hecho uso de la proteína EGFP con características óptimas de señal a ruido.
Debido a la complejidad de la replicación del virus de la viruela y la falta de herramientas existentes disponibles para ensayar los cambios en tiempo real en la expresión génica viral, hemos desarrollado una serie de virus reportero sola etapa y de múltiples 7,8. Como se ha descrito en publicaciones anteriores, estos virus expresan uno, dos, o tres proteínas fluorescentes espectralmente distintos promotores de vaccinia nativos durante principios, etapas intermedias o tardías de la infección. Estos virus pueden ser nosotrosed como indicadores de progreso de la replicación del virus utilizando un microscopio de fluorescencia y son igualmente adecuados para los ensayos de placa-y-lector basado en alto rendimiento. Estos virus son fáciles de usar en lugar del virus de tipo salvaje, creciendo con una cinética similar para alcanzar títulos equivalentes 7. Durante la planificación y creación de estos virus, mucho se tuvo cuidado en la selección de fluoróforos que tienen altas características de señal a fondo con la eficiencia de plegado superiores para facilitar la cuantificación fiable con retroalimentación rápida a los cambios en la expresión (Venus, mCherry y TagBFP). Además, se eligieron combinaciones de promotores virales que producen alta fidelidad, inequívoca expresión-etapa específica, el suministro de información sobre la gama completa de temprana (promotor C11R), intermedio (promotor G8R) y tardía (promotor F17R) la expresión de genes, en contraste con ambigua principios / finales de los promotores.
Estos virus pueden ser utilizados como una herramienta para la investigating el ciclo de vida del virus de la viruela, virus de la vacuna prototípica. Gran parte todavía no se sabe acerca de la interacción huésped-virus a pesar de su larga historia de estudio. Vaccinia es complejo, produciendo más de 200 proteínas únicas, muchas de las cuales son inmunomoduladores y albergan antagónica. Tras la infección, el virus vaccinia se inicia inmediatamente la transcripción de ARNm temprano. Esto es facilitado por una ARN polimerasa y los factores de transcripción que se cargaron en el genoma viral durante el envasado del virión y se mantienen en un estado de pausa hasta que la infección subsiguiente. Esta expresión temprana produce principalmente proteínas necesarias para la supresión del sistema inmune del huésped (ARNm decapping, el secuestro de dsRNA, y las proteínas de los receptores de señuelo, así como inhibidores de la apoptosis, la respuesta al estrés, y peaje, IL, y la señalización de NF-kappa B) y la replicación del genoma. Expresión temprana también produce factores de transcripción necesarios para la expresión intermedia. Expresión intermedia incluye la expresión de factores de transcripción etapa tardía. Estecascada de expresión conduce a la producción de proteínas del virus estructurales y enzimáticas durante las etapas tardías de la infección, que son necesarios para el montaje completo de la vaccinia virion maduro.
Nuestro conjunto de virus reportero fluorescentes permite un rápido progreso que se hará en la comprensión de la biología de los poxvirus. Uno de los métodos más comunes y que requieren mucho tiempo en el campo de la virología es el ensayo de crecimiento. Normalmente, esto implica la infección de células, la promulgación de una serie de tratamientos, el virus de la cosecha mediante la lisis de las células infectadas, y cuantificar el título viral resultante mediante ensayo en placa. Uso de los virus descritos aquí reportero permite la medición en tiempo real de crecimiento del virus que puede ser ensayada y se comparó entre los numerosos tratamientos realizados en paralelo fácilmente. Prevemos este conjunto de reactivos se utiliza en diversos protocolos para la identificación de alteraciones en la expresión génica viral en respuesta al tratamiento con fármacos, el ARNi knockdown o restricción gama de huéspedes.
Este método también permite el análisis de alto contenido en una escala mayor que la disponible anteriormente, lo que permite alto rendimiento pantallas de drogas antivirales para las etapas de destinatarios definidos específicamente-de interés. Aunque se han identificado numerosos tratamientos potenciales para combatir la infección por poxvirus, el único aprobado por la FDA terapias eficaces para el tratamiento de la infección por virus de la viruela son el nucleósido acíclico fosfonato, cidofovir, y el tratamiento con la vacuna inmune 9,10 globulina. A pesar de la erradicación de la viruela en 1977 11, poxvirus siguen siendo una amenaza considerable para la salud humana 12. El cese de la vacunación generalizada contra el virus de la viruela ha llevado a un aumento de la susceptibilidad a otros poxvirus 13. Por ejemplo, las regiones de África central que antes estaban protegidos por la vacunación están experimentando un aumento de las infecciones por virus del simio 14. Preocupación significativa también ha sidoplanteadas en relación con la susceptibilidad latente para la liberación intencional de virus de la viruela. Debido a las terapias limitadas disponibles actualmente, existe una necesidad urgente para el desarrollo de nuevos tratamientos. Estos virus informadores permiten la detección inhibidor de molécula pequeña rápida y de alto rendimiento para la inhibición de una etapa específica de la replicación viral. Identificación de inhibidores dirigidos a las etapas de expresión viral en la actualidad no es el objetivo de la inhibición facilitará el desarrollo de las terapias combinadas con una mayor potencia.
Mucho se puede extraer acerca de la biología celular de la vacuna mediante la observación de los cambios en la expresión génica de cada etapa. Atenuación por manipulación química o genética de una célula huésped infectada se expresa normalmente en términos de reducción de los títulos virales. Sin embargo, mediante la comparación de los cambios en cada etapa de la cascada de expresión viral, se puede obtener una comprensión más completa de cómo la aptitud virus es impactoed por un tratamiento en particular. Estos datos han sido demostrado que se correlaciona bien con la salida de título de virus tradicional, pero proporcionar información mecanicista más detallada, así como capacidades de alto rendimiento 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos descrito el uso práctico de un multi-etapa reportero virus vaccinia (TRPV), que proporciona medidas de retroalimentación en tiempo real reproducibles de la replicación del virus. Mediante el uso de inhibidores de poxvirus bien definidos, hemos sido capaces de demostrar que TRPV responde de una manera consistente con el mecanismo entendido de acción para cada inhibidor. Mientras que el virus TRPV proporciona la información más completa acerca de la progresión de la fase de virus, de dos etapas (iRev, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a las Tecnologías de SIGA (Corvallis, OR) para proporcionar ST-246. DKR fue apoyada por una beca de formación de los NIH en la inmunología de la Universidad de Boston (5T32AI 7309). Este trabajo fue apoyado en parte por P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, y SR3 (para JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
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