Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression
Summary
Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.
Abstract
Pockenviren sind eine Familie von Doppelstrang-DNA-Viren, die aktive menschliche Krankheitserreger wie Affenpocken, Dell contagiousum und Contagalo Virus enthalten. Die Familie umfasst auch die Pocken-Virus, Variola. Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation, bleiben noch viele Fragen hinsichtlich ihrer Genexpression Strategie. In diesem Artikel beschreiben wir die Konzeption und die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, die Echtzeitmessung von einzelnen und mehrfachen Stufen der viralen Genexpression in einem Format mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung von spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine als Reporter für jede der drei Phasen der Virusreplikation ermöglicht. Diese Viren einen hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis unter Beibehaltung Stufe spezifische Expressionsmuster, wodurch plattenbasierten Assays und mikroskopische Beobachtungen der Virus Vermehrung und Replikation. Diese Tools verwendet haben für antivirale Entdeckung, Studien der Virus-Wirt-Interaktion, und evolutionäre biologie.
Introduction
Traditionell wird Virus-Expressions mit molekularbiologischen Techniken (zB Northern Blot, Western Blot, Microarray-Hybridisierung, etc.) 1 untersucht. Diese Verfahren sind in der Lage, detaillierte Informationen in Bezug auf die Kategorisierung Expressionsänderungen der einzelnen mRNAs bzw. Proteine, sind sie typischerweise nicht zugänglich Echtzeit-und Hochdurchsatzverfahren. Alternative Ansätze mit Fluoreszenz-basierten Reporter haben bisher bei der Arbeit mit Pockenviren angewandt worden; hat jedoch ihre Entwicklung und Nutzung durch abwechslungsreiche Ziele motiviert. Mehrere solche Verfahren wurden zur Selektion von rekombinanten Viren 2,3 entwickelt. Diese Techniken auszudrücken EGFP auf ordnungsgemäße Einbau und die Expression von exogener DNA aus rekombinanten Vaccinia-Klonen. Ebenso mehrere Vacciniastämme stabil exprimieren EGFP löslich oder GFP-markierten Proteine unter einer nativen Vaccinia-Promotor exprimiert sind weit verbreitet. Diese sind typ.tisch verwendet werden, um das Eindringen von Viren und die Replikation während Antikörper-basierten Neutralisationstests, chemische Hemmung oder Vergleich der antiviralen Wirksamkeit 4-6 quantifizieren. Obwohl diese Viren nützlich erwiesen haben, sind sie in ihrer Fähigkeit, Informationen über den Punkt der Inhibition durch ihre Nutzung eines einzelnen mehrdeutigen frühen / späten viralen Promotor bereitzustellen begrenzt. Bisherige Verfahren haben auch die Verwendung von EGFP Protein gemacht mit suboptimalen Signal-zu-Rauscheigenschaften.
Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation und der Mangel an vorhandenen Werkzeugen zur Verfügung, um Echtzeit-Änderungen in der viralen Genexpression zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Einzel-und Mehrstufen-Reporter Viren 7,8 entwickelt. Wie bereits in früheren Veröffentlichungen beschrieben, diese Viren Ausdruck ein, zwei, oder drei spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen aus nativen Vaccinia-Promotoren in der frühen, mittleren oder späten Stadien der Infektion. Diese Viren können unsed als Indikatoren für die Virusreplikation Fortschritte mit einem Fluoreszenzmikroskop und die sie für Hochdurchsatz-Platte-basierte Assays Leser gleich gut geeignet sind. Diese Viren sind einfach anstelle des Wildtyp-Virus verwenden, wachsen mit ähnlichen Kinetik gleichwertige Titer 7 zu erreichen. Bei der Planung und Erstellung dieser Viren wurde viel Sorgfalt bei der Auswahl der Fluorophore, die hohen Signal-zu-Hintergrund-Merkmale mit überlegener Effizienz Klapp müssen zuverlässige Quantifizierung mit schneller Rückmeldung an Veränderungen in der Expression (Venus, mCherry und TagBFP) Erleichterung aufgenommen. Zusätzlich Kombinationen von viralen Promotoren wurden ausgewählt, die eine hohe Wiedergabetreue, eindeutige Phase-spezifische Expression, die Bereitstellung von Informationen über das gesamte Spektrum der früh (C11R-Promotor), Mittelstufe (G8R Promotor) und späten (F17R Promotor) Genexpression zu produzieren, im Gegensatz zu zweideutig frühen / späten Veranstalter.
Diese Viren können als ein Werkzeug verwendet werden, für investigating den Lebenszyklus des prototypischen Pockenvirus, Vaccinia-Virus. Vieles ist noch nicht bekannt über die Wirt-Virus-Interaktion trotz seiner langen Geschichte der Studie. Vaccinia ist komplex, produziert mehr als 200 einzigartige Proteine, von denen viele immunmodulatorische und hosten antagonistisch. Bei Infektion beginnt Vaccinia-Virus sofort frühen mRNA-Transkription. Dies wird durch eine RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren, die auf der viralen Genoms während der Virion Verpackungs geladen und in einem angehaltenen Zustand, bis nachfolgende Infektion gehalten wurden, erleichtert. Diese frühe Ausdruck produziert vor allem Proteine für die Unterdrückung der das Immunsystem des Wirts (mRNA Decapping, dsRNA-Sequestrierung und Köder Rezeptorproteine sowie Inhibitoren der Apoptose, Stressantwort und Toll, IL, und NF-kB-Signalisierung) und Genom-Replikation erforderlich. Frühe Ausdruck produziert auch Transkriptionsfaktoren für Zwischenausdruck erforderlich. Zwischen Ausdruck schließt die Expression von Transkriptionsfaktoren spät. DiesAusdruck Kaskade führt zur Produktion von strukturellen und enzymatischen Virusproteine während der späten Stadien der Infektion, die für die komplette Montage des reifen Virions Vaccinia notwendig sind.
Unsere Gruppe von fluoreszierenden Reporter-Viren ermöglicht rasche Fortschritte im Verständnis der Biologie Pockenvirus hergestellt werden. Eine der häufigsten und zeitraubenden Methoden auf dem Gebiet der Virologie ist die Wachstumstest. Dies beinhaltet typischerweise Infizieren von Zellen, Festlegung einer Reihe von Behandlungen, Virus-Ernte durch Lyse von infizierten Zellen und der Quantifizierung des erhaltenen Virustiter durch Plaque-Assay. Mit den hier beschriebenen Reporter Viren ermöglicht Echtzeit-Messung der Viruswachstum, die leicht untersucht und verglichen zwischen zahlreichen Behandlungen, die parallel ausgeführt werden können. Wir sehen dieses Set von Reagenzien werden in verschiedenen Protokollen für die Identifizierung Veränderungen im viralen Genexpression in Reaktion auf Medikamente, RNAi-k verwendet werdennockdown oder Wirtsspektrum Einschränkung.
Diese Methode ermöglicht auch High-Content-Analyse in einem größeren Maßstab als bisher zur Verfügung, so dass für Hochdurchsatz-Anti-Virus-Drogen-Bildschirme für speziell definierte Zielstufen von Interesse. Während zahlreiche mögliche Behandlungen zur Bekämpfung von Pockenvirus-Infektion identifiziert worden sind, die einzige von der FDA zugelassenen Therapien wirksam zur Behandlung von Pockenvirusinfektion sind die acyclischen Nucleosid-Phosphonats, Cidofovir, und Behandlung mit Vaccinia-Immunglobulin 9,10. Trotz der Ausrottung der Pocken im Jahr 1977 11, bleiben Pockenviren eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit 12. Einstellung der weit verbreiteten Impfung gegen Variola-Virus hat zu einer erhöhten Anfälligkeit für andere Pockenviren 13 geführt. Zum Beispiel werden die Regionen Zentralafrikas zuvor durch Impfung geschützt erleben einen Anstieg der Affenpocken-Virus-Infektionen 14. Erhebliche Bedenken hat auchhob in Bezug auf die latente Anfälligkeit für vorsätzliche Freisetzung von Variola-Virus. Aufgrund der begrenzten Therapien derzeit zur Verfügung, es besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen. Diese Reporterviren erlauben eine schnelle und Hochdurchsatz-Screening niedermolekularer Inhibitor zur Hemmung einer spezifischen Phase der Virusreplikation. Identifizierung von Inhibitoren, die viralen Expressions Stufen Ziel derzeit nicht das Ziel der Hemmung wird die Entwicklung von Kombinationstherapien mit erhöhter Potenz zu erleichtern.
Man kann viel über Vaccinia Zellbiologie durch Beobachtung von Veränderungen in jeder Stufe der Genexpression zu entnehmen. Dämpfung durch chemische oder genetische Manipulation einer infizierten Wirtszelle wird in der Regel in Form von geringeren Virustiter ausgedrückt. Doch beim Vergleich der Entwicklung in den einzelnen Phasen des viralen Expressionskaskade, kann man ein vollständigeres Verständnis der Virus-Fitness ist Auswirkungen zu erhaltendurch eine besondere Behandlung ed. Diese Daten haben gezeigt, dass auch mit der traditionellen Virustiter Ausgangs korrelieren, aber detailliertere mechanistische Informationen sowie hohe Durchsatzkapazitäten 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir den praktischen Einsatz eines mehrstufigen Vaccinia-Reportervirus (TRPV), die reproduzierbar ist, Echtzeit-Feedback Maßnahmen der Virusreplikation liefert beschrieben. Durch die Verwendung von gut definierten Pockenvirus-Inhibitoren, konnten wir zeigen, dass TRPV reagiert in einer Weise, die mit dem Wirkmechanismus verstanden, für jeden Inhibitor. Während die TRPV Virus bietet die umfassendsten Informationen über Viren Bühne Progression, zweistufig (IREV, LREV) und einstufigen (EV, IV, LV)-Viren kön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken SIGA Technologies (Corvallis, OR) für die Bereitstellung von ST-246. DKR wurde durch ein NIH Ausbildungsförderung in der Immunologie an der Universität Boston (5T32AI 7309) unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von P41 086180 unterstützt, NIH RO1AI1096159-01 und RO3 (bis JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas–monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
