Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов
Summary
Мы описываем использование флуоресцентного репортера вируса коровьей оспы, который позволяет в режиме реального времени измерения вирусной инфекционной и экспрессии генов через выражение стадии конкретных спектрально различных репортеров флуорофорами. Мы подробно метод пластина основе для точного определения стадии, на которой репликация вируса поражается в ответ на небольшой торможения молекулы.
Abstract
Поксвирусы представляют собой семейство двухцепочечной ДНК вирусов, которые включают активные человеческих патогенов, таких как обезьян, моллюск contagiousum и вирус Contagalo. Семья также включает в себя вирус оспы, оспы. Из-за сложности поксвирусной репликации, многие вопросы все еще остаются относительно их стратегии экспрессии генов. В этой статье мы расскажем концептуализации и использование рекомбинантных вирусов осповакцины, которые позволяют в режиме реального времени измерения одного и нескольких стадиях вирусной экспрессии генов в формате высокой пропускной. Это возможно за счет использования спектрально различных флуоресцентных белков в качестве репортеров для каждой из трех стадий репликации вируса. Эти вирусы обеспечивают высокую отношение сигнал-шум, сохраняя при этом характер экспрессии этапе, позволяющие плиты на основе анализов и микроскопические наблюдения размножения вируса и репликации. Эти инструменты имеют использует для противовирусной открытия, исследования вируса-хозяина взаимодействия, и эволюционной биология.
Introduction
Традиционно, выражение вирус изучается с помощью молекулярных методов (например, северная блоттинга, вестерн-блоттинга, микрочипов гибридизации, и т.д.) Биология 1. Хотя эти методы способны обеспечить подробную информацию относительно классификации изменений экспрессии отдельных мРНК или белков, они, как правило, не поддаются реального времени и высокой пропускной процессов. Альтернативные подходы с помощью флуоресцентной основе журналистам были применены ранее при работе с поксвирусов; Однако, их развитие и использование, был мотивирован разнообразных целей. Несколько таких методов были разработаны для отбора рекомбинантных вирусов 2,3. Эти методы выразить EGFP при правильном включении и экспрессии экзогенной ДНК из рекомбинантных коровьей клонов. Аналогичным образом, несколько штаммов вируса осповакцины, стабильно экспрессирующие растворимый EGFP или GFP с метками белки, экспрессированные под нативного промотора коровьей оспы были широко использованы. Это типчески используется для количественной запись вируса и репликации во время на основе антител нейтрализации анализов, химическую ингибирование, или сравнение противовирусной эффективности 4-6. В то время как эти вирусы оказались полезными, они ограничены в своей способности обеспечить подробную информацию о точке торможения из-за их использования одного неоднозначного начале / конце вирусного промотора. Предыдущие методы также использовали EGFP белка с субоптимальными сигнал-шум характеристик.
Из-за сложности поксвирусной репликации и отсутствием существующих инструментов, доступных для анализа изменений в режиме реального времени в экспрессии вирусных генов, мы разработали набор одно-и многоступенчатый репортер вирусов 7,8. Как описано в предыдущих публикациях, эти вирусы выразить один, два, или три спектрально различных флуоресцентных белков из родных промоутеров коровьей во время рано, промежуточные или поздно этапы инфекции. Эти вирусы могут быть намред качестве индикаторов прогресса репликации вируса с помощью флуоресцентного микроскопа, и они одинаково хорошо подходит для высокой пропускной пластина-и-ридер на основе анализов. Эти вирусы очень легко использовать вместо вируса дикого типа, растет с аналогичными кинетики достичь эквивалентные титры 7. В ходе планирования и создания этих вирусов, гораздо внимание было уделено в выборе флуорофоры, которые имеют высокий сигнал-фон характеристики с превосходной эффективности складной для облегчения надежную количественную с быстрым обратной связи с изменениями в выражении (Венера, mCherry и TagBFP). Кроме того, комбинации вирусных промоутеров были выбраны, которые производят высокую точность, однозначное выражение этап конкретных, предоставляя информацию о полном диапазоне рано (C11R промоутер), промежуточный (G8R промотор) и поздний (F17R промоутер) экспрессию генов, в отличие от неоднозначной ранний / поздний промоторы.
Эти вирусы могут быть использованы в качестве инструмента для INVEstigating жизненный цикл прототипа поксвирусной, вирус коровьей оспы. Многое до сих пор не известно о хозяине-вируса взаимодействия, несмотря на свою долгую историю изучения. Коровьей оспы является сложной, выпускающее более 200 уникальных белков, многие из которых являются иммуномодулирующее и принимающих антагонистическими. При заражении вирус коровьей оспы немедленно начинает транскрипцию мРНК раннее. Этому способствует РНК-полимеразы и транскрипционных факторов, которые были загружены на вирусного генома в ходе вириона упаковки и не состоявшихся в приостановленном состоянии до последующей инфекции. Это раннее выражение в основном производит белки, необходимые для подавления иммунной системы хозяина (мРНК decapping, секвестрации дцРНК, и приманки рецепторных белков, а также в качестве ингибиторов апоптоза, реакции стресс, и Toll, IL, и сигнализации NF-kB) и геном репликации. Рано выражение также производит транскрипционные факторы, необходимые для промежуточного выражения. Промежуточный выражение включает экспрессию конце факторов этап транскрипции. Этовыражение каскад приводит к производству структурных и ферментативных белков вируса на поздних стадиях инфекции, которые необходимы для полной сборки зрелого коровьей оспы вириона.
Наш набор флуоресцентных репортер вирусов позволяет быстро добиться прогресса в понимании поксвирусной биологии. Один из наиболее распространенных и трудоемких методов в области вирусологии является анализ роста. Это обычно включает инфицировать клетки, принятие ряд процедур, вирус уборочной лизированием инфицированные клетки, и количественной полученный титр вируса на бляшек. Использование репортерных вирусы, описанные здесь позволяет в режиме реального времени измерение роста вируса, который может быть легко проанализированы и сравнены между многочисленных процедур, выполняемых параллельно. Мы предполагаем этот набор реагентов будет использоваться в различных протоколов для определения изменений в экспрессии вирусного гена в ответ на обработку препарата, RNAi кnockdown или диапазон хозяин ограничение.
Этот метод также позволяет проводить анализ высокого содержания в большем масштабе, чем ранее доступные, что позволяет с высокой пропускной противовирусных лекарств для экранов конкретно определенных целевых стадий интерес. В то время как многочисленные потенциальные обработки по борьбе поксвирусной инфекции были выявлены, только FDA одобрило терапии эффективные для лечения поксвирусной инфекции являются ациклические фосфонатный нуклеозид, Цидофовир, и лечение с иммуноглобулин коровьей оспы 9,10. Несмотря на ликвидации оспы в 1977 году 11, поксвирусы остаются серьезной угрозой для здоровья человека 12. Прекращение широкого вакцинации против вируса натуральной оспы привело к повышенной восприимчивости к другим поксвирусов 13. Например, регионы Центральной Африке ранее защищенные вакцинации переживают всплеск вирусных инфекций Обезьянья 14. Значительное беспокойство также был, заданный в отношении скрытой предрасположенности к преднамеренного высвобождения вируса натуральной оспы. В связи с ограниченностью методов лечения в настоящее время, существует настоятельная потребность в разработке новых методов лечения. Эти вирусы репортер позволяют быстро и высокопроизводительного скрининга малую молекулу ингибитора для ингибирования определенной стадии вирусной репликации. Идентификация ингибиторов, предназначенных вирусные этапы экспрессии в настоящее время не является целью торможения будет способствовать развитию комбинированной терапии с повышенной эффективностью.
Многое можно почерпнуть о биологии коровьей оспы клеток, наблюдая изменения в экспрессии генов для каждого этапа,. Ослабление в химической или генетической манипуляции с инфицированной клетки-хозяина, как правило, выражается в виде сокращения вирусных титров. Тем не менее, путем сравнения изменения в каждой стадии вирусной экспрессии каскада, можно получить более полное понимание того, как вирус подготовка является воздействиеред конкретным лечения. Эти данные, как было показано, хорошо коррелирует с традиционным выхода титра вируса, но предоставить более подробную информацию механистическую, а также высокой пропускной способности 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали практического использования многоступенчатой вакцины репортера вируса в (TRPV), что обеспечивает воспроизводимые в режиме реального времени меры обратной репликации вируса. С помощью четко определенных ингибиторов поксвирус, мы смогли показать, что TRPV отвечает в со…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим SIgA технологий (Corvallis, OR) для обеспечения ST-246. ДКР была поддержана учебного гранта NIH в иммунологии в Бостонском университете (5T32AI 7309). Эта работа была частично поддержана P41 086180, NIH RO1AI1096159-01, и RO3 (в JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas–monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
