Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu
Summary
Virüs enfeksiyonlarına karşı doğal savunma örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından tetiklenir. İki sitoplazmik PRR'ler Rig-I ve viral imza RNA'lar, değişim konformasyon, oligomerleşip ve antiviral sinyalini etkinleştirmek için PKR bağlamak. Yöntem, uygun yapısal anahtarlama ve bu sitoplazmik PRRS en oligomerizasyonu izlemek için izin tarif edilmiştir.
Abstract
Virüs enfeksiyonu konak savunması doğuştan gelen bağışıklık sisteminin örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından hızlı bir algılama bağlıdır. Sitoplazmada, PRR Rig-I ve belirli viral RNA ligandlarına PKR bağlanır. Bu, ilk olarak yapısal ve anahtarlama oligomerizasyonu aracılık etmekte ve daha sonra bir anti-viral tepki interferon aktivasyonunu sağlar. Antiviral bir ev sahibi gen ekspresyonunu ölçmek için yöntemler iyi kurulmuş olsa da, doğrudan Rig-I ve PKR'nin aktivasyon durumları izlemek için yöntemler, sadece kısmen ve daha az iyi bilinmektedir.
Burada, kurulu bir interferon indükleyici, Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (CI 13) ile enfeksiyon üzerine Rig-I ve PKR stimülasyon izlemek için iki yöntem tarif eder. Sınırlı tripsin sindirim PRRS şekilsel değişiklikleri gösteren, proteaz duyarlılık değişiklikleri analiz etmeyi sağlar. Rig-I ve PKR, anlamlara sahiptir: hızlı bir şekilde bozunması ile sahte enfeksiyonlu hücreler sonuçlarından lizatlarının tripsin sindirims Cı 13 enfeksiyonu bir peptidaza dayanıklı Rig-I fragmanının ortaya çıkmasına yol açar. Ayrıca PKR Thr 446 onun ayar damgası fosforilasyonu ile çakışmaktadır tripsin sindirim, bir virüs kaynaklı kısmi bir direnç gösterir. Rig-I ve PKR oligomerleri yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile doğrulandı oluşumu. Bu proteinlerin örnekleri sahte enfekte monomer olarak kalmıştır oysa enfeksiyon üzerine, Rig-I ve PKR oligomerik kompleksleri güçlü bir birikimi bulunmaktadır.
Sınırlı proteaz sindirimi ve yerel PAGE, Rig-I ve PKR aktivasyon iki farklı adımları bir hassas ve doğrudan bir ölçüm sağlar, western blot analizi bağlanmış iki. Bu teknikler nispeten kolay ve gerçekleştirmek için hızlı ve pahalı ekipman gerektirmez.
Introduction
Antiviral konak savunmasında çok önemli bir etkinlik sözde görüntü tanıma reseptörleri (PRR) 1,2 patojeni hızlı tespit edilmesidir. RNA virüs enfeksiyonu tespiti, iki hücre içi sitoplazmik RNA sarmallara Rig-I (retinoik asit olarak uyarılabilir bir gen I) 'in ve MDA5 (melanoma farklılaşma ilişkili protein 5) 3-5 bağlıdır. Rig-I, iki N-ucu kaspaz alım alanları (kart), merkezi bir Dech kutu tipi RNA helikaz etki alanı ve bir C-terminal alanının (CTD) 4,6 oluşmaktadır. CTD ve sarmal etki non-self (viral) RNA'lar tanınması için gerekli ise, kARtlARI bir antiviral sahibi durumundaki kurulmasına yol açan aşağı sinyalizasyon aracılık.
Rig-I, belirli bir RNA ligandın yokluğunda yani sessiz durum içinde ise, ikinci bir kart merkezi sarmal alanı ile etkileşime girer ve bir otomatik engelleyici konformasyonunda 7-11 Rig-I tutar. Rig-Ben kısa bağlanır çiftbir 5'-trifosfat (5'PPP) ve uzun dsRNA, polyU ve / UC açısından zengin RNA, birçok DNA virüsünün 12-16 genomlarında üzerinde mevcut olan klasik imza yapıları taşıyan iplik (ds) RNA. Rig-I aktivasyonu iki temel özellikleri kapalı konformasyon 6,17 ve homo-oligomerizasyonun 6,18,19 bir anahtar vardır. Yapısal anahtarı, RNA bağlayıcı geliştirir aşağı sinyalizasyon için kartlar ortaya, ve aktif bir ATPaz sitesi 8,9,11,20 yeniden oluşturulmasını. Oligomerik Rig-I komplekslerinin oluşumu antiviral sinyal iletimi 11 için bir platform oluşturmak için aşağı doğru sinyal adaptör moleküllerinin gelişmiş işe yol açar. Rig-I-regüle sinyal zinciri sonunda transkripsiyon faktörünü aktive IRF-3 için yukarı-regülasyonu tam bir antiviral karşılık 21,22 için interferon (IFN-alpha/beta) genleri ve interferon uyarılan genlerin dolayısıyla gen ifadesi (ISGs) arasında . En iyi karakterize edilmiş ISGs bir RNA ile aktive olan Protein kinaz (PKR) 23. PKR ökaryotik translasyon başlatma faktörü alfa 2 (eIF2α) kinazları ailesine ait olan ve bir N-terminal çift-şeritli RNA bağlama alanı ve bir C-terminal kinaz oluşmaktadır. Kinaz etki PKR dimerizasyon aktivasyonu için önemli bir arayüz oluşturur ve proteinin katalitik işlevleri yerine getirir. Viral dsRNA PKR bağlanması, bunun yapısal değişiklik diğer artıklar arasında yer Thr 446 dimerizasyonu ve oto-fosforilasyonunu izin yol açar. PKR sonra bu şekilde viral mRNA 23-27 çevirisini bloke eIF2α fosforilasyonunu aracılık eder.
Rig-I ve PKR her ikisi de, önemli bir yapısal yeniden düzenlemeleri geçmesi oligomerik kompleksler oluşturmak ve post-translasyonel fosforilasyon / defosforilasyon ve ubikitinasyon 10,11,19,23,24,26-29 ile tadil edilmiş metilalümoksandır. Viral RNA yapıları Rig-I ve PKR'yi aktive edilir (ve hangi aşamada viral antagonist b olabilecek daha iyi anlaşılması içine) müdahale, bu tam etkinleştirme durumunu belirlemek için önemlidir. Her iki PRRS için bir önceki aktivasyon trypsin'e dirençli protein fragmanlarının 6,17,30 ve daha yüksek dereceden oligomerlerin 6,18,19 ortaya çıkmasına yol açar tanımlanmıştır. Ancak, antiviral konak yanıtının 1,2,24 bu anahtar faktörlere edebiyatının zenginliği göz önüne alındığında, doğrudan yöntemler uygulama nispeten nadir görünüyor. Geniş kullanım uyarıcı umuduyla olarak, sağlam Rig-I ve PKR'nin aktivasyon durumları analiz etmek için uygun ve hassas protokolleri sağlar. IFN yetkin insan hücre hattı A549 Rig-I ve PKR, zayıflatılmış Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (Cı-13) 31,32 yerleşik bir aktivatör ile enfekte edilir. Basit bir parçalama işleminden sonra, enfekte olmuş hücrelerin ekstreleri konformasyonel geçiş değerlendirmek için sınırlı tripsin sindirim / western blot analizi ile test edildi ve mavi olan yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) / Western blot analizi çalışan tarafındanoligomerlerin oluşumunu ölçmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virüslerin varlığı ve sistem IFN antiviral Çeşidi aktivasyonunu algılama başarılı bir doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin 22 için çok önemlidir. Virüs algılama ve böylece hızlı bir tepki ve antiviral savunma mekanizmalarının aktivitesini sağlayan, Rig-I ve PKR gibi patojen tanıyan reseptörler (PRR) aracılık eder. Burada, doğrudan Rig-I ve PKR aktivasyon durumunu değerlendirmek için iki yöntem açıklanmaktadır.
Rig-I ve PKR'nin yapısal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz anti-Rift Vadisi Humması Virüs serumları sağlamak için CISA-INIA Alejandro Brun teşekkür ederim. Bizim laboratuarlarımızda çalışma Forschungsförderung taş tarafından desteklenmektedir. 2. Abs §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Gelişen viral hastalıklar için Leibniz Enstitüsü (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 ve DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. . A structure-based model of RIG-I activation. 18, 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles’ recognition of 5′-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. . RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. , 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. . 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5′-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
