Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE
Summary
Angeborene Abwehr von Virus-Infektionen werden durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ausgelöst. Die beiden zytoplasmatischen PRRs RIG-I und PKR binden an viralen RNAs Unterschrift, ändern Konformation oligomerisieren, und aktivieren antivirale Signalisierung. Es werden Methoden beschrieben, die um die Konformationsänderungen Schalten und die Oligomerisierung dieser zytoplasmatischen PRRs bequem überwachen.
Abstract
Wirtsabwehr Virus-Infektion sind abhängig von einer schnellen Erkennung von Mustererkennungsrezeptoren (PRR) des angeborenen Immunsystems. Im Zytoplasma PRRS RIG-I und PKR binden an spezifische virale RNA-Liganden. Dies vermittelt ersten Konformationsänderung Schalt-und Oligomerisierung, und dann können die Aktivierung eines antiviralen Interferon-Antwort. Während Methoden zur antiviralen Wirts Genexpression zu messen sind gut etabliert, Methoden, um die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR direkt zu überwachen sind nur teilweise und weniger gut etabliert.
Hier beschreiben wir zwei Methoden, um RIG-I und PKR Stimulation bei der Infektion mit einem etablierten Interferon-Induktor, der Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) zu überwachen. Begrenzte Trypsin Verdauung ermöglicht Änderungen der Proteaseempfindlichkeit zu analysieren, was auf Konformationsänderungen des PRRS. Trypsin Verdauung von Lysaten aus mock-infizierten Zellen führt zu einem schnellen Abbau von RIG-I und PKR, whereas Cl 13 Infektion führt zu der Entstehung eines Protease-resistenten RIG-I-Fragment. PKR auch eine Virus-induzierte Teilwiderstand Trypsin Verdauung, die mit ihrem Stempel Phosphorylierung an Thr 446 zusammenfällt. Die Bildung von RIG-I und PKR Oligomere wurde durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. Bei Infektion, gibt es eine starke Anhäufung von RIG-I und PKR oligomeren Komplexen, während diese Proteine blieb als Monomere in mock infizierten Proben.
Begrenzte Proteaseverdau und native PAGE, sowohl für Western-Blot-Analyse gekoppelt sind, erlauben eine sensible und direkte Messung von zwei verschiedenen Schritte des RIG-I und PKR-Aktivierung. Diese Techniken sind relativ einfach und schnell durchzuführen und keine teure Ausrüstung.
Introduction
Ein entscheidendes Ereignis in der antiviralen Wirtsabwehr ist die schnelle Nachweis des Erregers durch die so genannte Mustererkennungsrezeptoren (PRR) 1,2. Intrazellulären Nachweis von RNA-Virus-Infektion ist abhängig von zwei cytoplasmatischen RNA-Helikasen, RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen-I) und MDA5 (Melanomdifferenzierung-assoziiertes Protein 5) 3-5. RIG-I besteht aus zwei N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomänen (Karten), einer zentralen DECH-box Typ-RNA-Helikase-Domäne und einer C-terminalen Domäne (CTD) 4,6 zusammen. Während die CTD und die Helikase-Domäne für die Anerkennung von Nicht-Selbst (viral) RNAs erforderlich, die Karten vermitteln nachgeschalteten Signal der zur Schaffung eines antiviralen Wirts Status.
Wenn RIG-I im stillen Zustand, dh in Abwesenheit von einem bestimmten RNA-Liganden interagiert der zweiten Karte mit der zentralen Helikasedomäne und hält RIG-I in einem Auto-hemmende Konformation 11.07. RIG-I bindet an kurze doppelsträngigeStrang (ds) RNA trägt ein 5'-Triphosphat (5'PPP), lange dsRNA und PolyU / UC-reiche RNA, klassische Unterschrift Strukturen, die auf die Genome vieler RNA-Viren 12-16 vorhanden sind. Zwei wichtige Eigenschaften von RIG-I-Aktivierung sind ein Schalter in eine geschlossene Konformation 6,17 und der Homo-Oligomerisierung 6,18,19. Die Konformationsänderung Schalter erhöht RNA-Bindung, macht die Karten für nachgeschalteten Signal und rekonstruiert eine aktive ATPase Website 8,9,11,20. Die Bildung von oligomeren RIG-I-Komplexe führt zu verbesserten Einstellung nachgeschalteten Signaladaptermoleküle, um eine Plattform für antivirale Signaltransduktion 11 zu bilden. Das RIG-I-regulierten Signalkette schließlich aktiviert den Transkriptionsfaktor IRF-3 für die Hochregulierung von Interferon (IFN-alpha/beta)-Gene und damit die Genexpression von Interferon-stimulierten Gene (ISG) für eine volle antivirale Antwort 21,22 . Eines der am besten charakterisierten ISG ist die RNA-aktivierten Protein-Kinase (PKR) 23. PKR gehört zur Familie der eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF2a)-Kinasen und ist aus einem N-terminalen Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne zusammengesetzt. Die Kinasedomäne bildet die Dimerisierung wichtig für PKR-Aktivierung und führt die katalytische Funktion des Proteins. Die Bindung von PKR, um virale dsRNA führt zu dessen Konformationsänderung ermöglicht die Dimerisierung und Auto-Phosphorylierung an Thr 446 unter anderem Rückstände. PKR vermittelt dann die Phosphorylierung von eIF2a, wodurch die Translation viraler mRNAs 23-27 blockieren.
Sowohl RIG-I und PKR unterziehen großen strukturellen Umlagerungen, bilden oligomere Komplexe und posttranslational durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung und Ubiquitinierung 10,11,19,23,24,26-29 modifiziert. Für ein besseres Verständnis von der viralen RNA-Strukturen Aktivierung RIG-I und PKR (und in welchem Stadium viralen Antagonisten könnte be stören), ist es wichtig, den Aktivierungszustand genau zu bestimmen. Für beide KFVs wurde zuvor beschrieben, dass die Aktivierung führt zur Entstehung von Trypsin-resistenten Proteinfragmente 6,17,30 und Oligomeren höherer Ordnung 6,18,19. Doch angesichts der Fülle von Literatur über diese Schlüsselfaktoren der Reaktion der antiviralen Wirts 1,2,24, Anwendung der direkten Methoden scheint vergleichsweise selten. In der Hoffnung auf anregende breitere Nutzung, bieten wir bequeme und sensible Protokolle robust analysieren die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR. Die IFN zuständigen menschlichen Zelllinie A549 ist mit einem etablierten Aktivator von RIG-I und PKR, der gedämpft Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) 31,32 infiziert. Nach einer einfachen Lyseverfahren sind die Extrakte aus infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung begrenzt / Western-Blot-Analyse getestet, um Konformationsänderungen Schalt bewerten und durch blaue nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) / Western Blot analysist, um die Bildung von Oligomeren zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erfassen der Anwesenheit von Viren und die Aktivierung des antiviralen Typ I IFN-Systems sind entscheidend für eine erfolgreiche angeborenen Immunantworten 22. Virenerkennung wird dabei durch Erreger recognition receptors (PRR), wie RIG-I und PKR vermittelte, was eine schnelle Reaktion und Aktivierung der antiviralen Abwehrmechanismen. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um den Aktivierungsstatus des RIG-I und PKR direkt auswerten.
Begrenzte Proteaseverdau als Werkzeug, um Konfor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Alejandro Brun von KAG-INIA für die Bereitstellung von Anti-Virus Rift Valley Fieber Seren. Die Arbeit in unseren Labors wird durch Forschungsförderung gem unterstützt. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Gießen und Marburg, die Leibniz Graduate School für Schwellen-Viruserkrankungen (EIDIS), dem DFG-Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, und die DFG-Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
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