Attivazione Monitoraggio del Pattern Recognition antivirale recettori RIG-I E PKR By limitata proteasi Digestione e PAGE Native
Summary
Difese innate alle infezioni virali sono attivati da recettori di pattern recognition (PRR). I due PRRs citoplasmatici RIG-I e PKR legano a RNA virali firma, il cambiamento di conformazione, oligomerize, e attivare la segnalazione antivirale. Metodi sono descritti che consentono di tenere sotto controllo la commutazione conformazionale e l'oligomerizzazione di questi PRRs citoplasmatici.
Abstract
Difese dell'ospite all'infezione da virus dipendono da una rapida individuazione da parte dei recettori pattern recognition (PRR) del sistema immunitario innato. Nel citoplasma, i PRRs RIG-I e PKR legano a specifici ligandi di RNA virale. Questa prima media commutazione conformazionale e oligomerizzazione e quindi permette l'attivazione di una risposta interferone antivirale. Mentre i metodi per misurare l'espressione genica ospite antivirale sono ben stabiliti, i metodi per monitorare direttamente gli stati di attivazione del RIG-I e PKR sono solo parzialmente e meno ben stabilite.
Qui, descriviamo due metodi per monitorare RIG-I e PKR stimolazione al momento dell'infezione, con un induttore di interferone stabilita, il virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13). Tripsina digestione limitata permette di analizzare alterazioni nella sensibilità proteasi, indicando cambiamenti conformazionali delle PRRs. Tripsina digestione dei lisati da finte infetti cellule si traduce in una rapida degradazione di RIG-I e PKR, whereas Cl 13 infezione porta alla nascita di un RIG-I frammento resistente alle proteasi. Anche PKR mostra una resistenza parziale virus-indotto a digestione con tripsina, che coincide con la sua caratteristica fosforilazione in Thr 446. La formazione di RIG-I e oligomeri PKR ha convalidato nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). Al momento dell'infezione, vi è un forte accumulo di RIG-I e PKR oligomeri, che queste proteine sono rimasti come monomeri in campioni infetti finto.
Digestione proteasi Limited e PAGE nativo, entrambi accoppiati ad analisi Western Blot, consentono una misurazione sensibile e diretto di due diverse fasi di RIG-I e l'attivazione PKR. Queste tecniche sono relativamente facili e veloci da eseguire e non richiedono attrezzature costose.
Introduction
Un evento cruciale nella difesa ospite antivirale è il rapido rilevamento del patogeno da parte dei cosiddetti recettori pattern recognition (PRR) 1,2. Rilevamento intracellulare di infezione da virus RNA dipende da due elicasi RNA citoplasmatici, RIG-I (acido retinoico gene inducibile I) e md5 se si usano (differenziazione melanoma associato proteine 5) 3-5. RIG-I è composto di due domini N-terminali caspasi assunzione (CARDs), un tipo DECH-box dominio RNA elicasi centrale, e un dominio C-terminale (CTD) 4,6. Considerando che il CTD e il dominio elicasi sono necessari per il riconoscimento del non-self (RNA virale), le carte mediare segnalazione a valle che porta alla creazione di uno stato di ospite antivirale.
Se RIG-I è nello stato silenzioso, cioè in assenza di uno specifico ligando di RNA, la seconda carta interagisce con il dominio elicasi centrale e mantiene RIG-I in un auto-inibitrice conformazione 7-11. RIG-I si lega a breve doppiofilamento (ds) RNA recante un 5'-trifosfato (5'PPP), lungo dsRNA, e poliureta / UC-ricchi RNA, strutture firma classici che sono presenti sui genomi di molti virus a RNA 12-16. Due importanti caratteristiche di attivazione RIG-I sono un passaggio a una conformazione chiusa 6,17 e omo-oligomerizzazione 6,18,19. L'interruttore conformazionale migliora RNA vincolante, espone le schede per la segnalazione a valle, e ricostituisce un sito ATPasi attivo 8,9,11,20. La formazione di oligomeri RIG-I porta ad una maggiore assunzione di molecole adattatrici segnalazione a valle per formare una piattaforma per antivirale trasduzione del segnale 11. La catena di segnalazione RIG-I-regolato casualmente attiva il fattore di trascrizione IRF-3 per up-regolazione di interferone (IFN-alpha/beta) geni e quindi l'espressione del gene dell'interferone stimolato geni (ISGS) per una completa risposta antivirale 21,22 . Uno dei migliori caratterizzato ISGS è la protei RNA-activatedn chinasi (PKR) 23. PKR appartiene alla famiglia delle eucariotico traduzione iniziazione fattore alfa 2 (eIF2α chinasi) ed è composto da un doppio filamento RNA dominio di legame N-terminale e un dominio chinasi C-terminale. Il dominio di chinasi costituisce l'interfaccia dimerizzazione cruciale per l'attivazione PKR e svolge le funzioni catalitiche della proteina. Il legame di PKR a dsRNA virale porta al suo cambiamento conformazionale che consente dimerizzazione e auto-fosforilazione in Thr 446 tra gli altri residui. PKR poi media fosforilazione di eIF2α, bloccando così la traduzione di mRNA virale 23-27.
Entrambi RIG-I e PKR subisco grandi riarrangiamenti strutturali, formare complessi oligomerici e sono post-traduzionali modificato dalla fosforilazione / defosforilazione e di ubiquitinazione 10,11,19,23,24,26-29. Per una migliore comprensione dei quali strutture di RNA virali stanno attivando RIG-I e PKR (e in quale fase antagonisti virali potrebbe be interferenza), è importante determinare con precisione lo stato di attivazione. Per entrambi PRR è stato descritto in precedenza che l'attivazione porta alla nascita di frammenti proteici tripsina-resistente 6,17,30 e oligomeri di ordine superiore 6,18,19. Tuttavia, data la ricchezza di letteratura su questi fattori chiave della risposta dell'ospite antivirale 1,2,24, applicazione di metodi diretti sembra relativamente rari. Nella speranza di stimolare l'utilizzo più ampio, forniamo protocolli convenienti e sensibili per analizzare con fermezza gli stati di attivazione del RIG-I e PKR. L'IFN competente A549 linea cellulare umana è stato infettato da un attivatore consolidata di RIG-I e PKR, la attenuato virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Dopo una semplice procedura di lisi, gli estratti di cellule infette sono testati dalla limitata tripsina digestione / Western Blot per valutare switching conformazionale, e blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGINA) / Analys Western Blotè quello di misurare la formazione di oligomeri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Percependo la presenza di virus e l'attivazione del tipo antivirale IFN sistema sono cruciali per il successo delle risposte immunitarie innate 22. Rilevamento di virus viene così mediata da recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR) come RIG-I e PKR, consentendo una risposta rapida e l'attivazione dei meccanismi di difesa antivirale. Qui, descriviamo due metodi per valutare direttamente lo stato di attivazione di RIG-I e PKR.
Digestione proteasi limitata come strumen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Alejandro Brun dal CISA-INIA per la fornitura di anti-febbre della Rift Valley Virus sieri. Il lavoro nei nostri laboratori è supportato da Forschungsförderung gioiello. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, il Leibniz Graduate School per le malattie virali emergenti (EIDIS), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, e la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
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