Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native
Summary
Défenses innées à des infections virales sont déclenchés par des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Les deux PRR cytoplasmiques RIG-I et PKR se lient aux ARN viraux de signature, le changement de conformation, oligomérisation, et activer la signalisation antiviral. Les méthodes sont décrites qui permettent de surveiller facilement la commutation de conformation et l'oligomérisation de ces PRR cytoplasmiques.
Abstract
Défenses de l'hôte à l'infection par le virus dépendent d'une détection rapide par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) du système immunitaire inné. Dans le cytoplasme, les PRR RIG-I et de PKR se lient à des ligands spécifiques d'ARN viral. Cette première commutation assure la médiation de conformation et l'oligomérisation, et permet ensuite l'activation d'une réponse antivirale de l'interféron. Bien que les méthodes de mesure de l'expression des gènes de l'hôte antiviral sont bien établis, des méthodes pour surveiller directement les états d'activation de RIG-I et PKR ne sont que partiellement et moins bien établis.
Ici, nous décrivons deux méthodes pour surveiller RIG-I et PKR stimulation lors de l'infection avec un inducteur d'interféron établie, le virus vallée du Rift clone mutant 13 (Cl 13). Digestion de la trypsine limité permet d'analyser les modifications de la sensibilité de la protéase, indiquant des changements de conformation des PRR. Digestion par la trypsine de lysats de maquettes résultats cellules infectées à une dégradation rapide de RIG-I et PKR, whereas Cl 13 infection conduit à l'émergence d'un RIG-I fragment résistant aux protéases. Aussi PKR présente une résistance partielle induite par le virus de la digestion de la trypsine, qui coïncide avec sa marque de fabrique de la phosphorylation au niveau de Thr 446. La formation de RIG-I et oligomères PKR a été validé par électrophorèse native sur gel de polyacrylamide (PAGE). Lors de l'infection, il existe une forte accumulation de complexes d'oligomères PKR RIG-I et, alors que ces protéines sont restés en tant que monomères dans des échantillons infectés simulés.
Digestion de protéase Limited et PAGE native, à la fois couplées à une analyse Western blot, permet une mesure sensible et directe de deux différentes étapes de RIG-I et l'activation de PKR. Ces techniques sont relativement faciles et rapides à réaliser et ne nécessitent pas un équipement coûteux.
Introduction
Un événement crucial dans la défense antivirale de l'hôte est la détection rapide de l'agent pathogène par les soi-disant récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) 1,2. La détection intracellulaire de l'infection par le virus à ARN est dépendante de deux hélicases d'ARN cytoplasmique, RIG-I (gène inductible par l'acide rétinoïque I) et MDA5 (différenciation des mélanomes protéine associée 5) 3-5. RIG-I est composée de deux domaines N-terminaux recrutement de caspase (CARDS), un domaine ARN hélicase de type DECH-caisson central, et un domaine C-terminal (CTD) 4,6. Considérant que le CTD et le domaine hélicase sont nécessaires pour la reconnaissance de la non-autonomes (ARN viraux), les cartes médiation signalisation en aval conduisant à l'établissement d'un statut d'hôte antiviral.
Si RIG-I est à l'état silencieux, c'est à dire en l'absence d'un ligand d'ARN spécifique, la deuxième carte interagit avec le domaine hélicase central et maintient RIG-I dans une conformation d'auto-inhibition de 7-11. RIG-I se lie à court doublebrin (ds) ARN portant un 5'-triphosphate (5'PPP), à long ARN double brin et l'ARN polyU / UC-riche, structures de signature classiques qui sont présents sur les génomes de nombreux virus à ARN de 12-16. Deux caractéristiques majeures de RIG-I activation sont un commutateur à une conformation fermée 6,17 et l'homo-oligomérisation 6,18,19. L'interrupteur conformationnel améliore liaison à l'ARN, expose les cartes pour la signalisation en aval, et reconstitue un site ATPase actif 8,9,11,20. La formation de complexes oligomères RIG-I conduit à accroître le recrutement de molécules d'adaptateurs en aval de la signalisation pour former une plate-forme pour la transduction du signal 11 antiviral. La chaîne de signalisation RIG-I-régulé éventuellement active le facteur de transcription IRF-3, pour la régulation de l'interféron (IFN-alpha/beta) gènes et par conséquent l'expression génique de gènes stimulés par l'interféron (ISG) pour une réponse antivirale complète 21,22 . L'un des meilleurs ISGs caractérisé est le protei ARN activén kinase (PKR) 23. PKR appartient à la famille du facteur d'initiation de traduction eucaryote alpha 2 (eIF2α) kinases et est composé d'un domaine de liaison à N-terminal de l'ARN double brin et un domaine de kinase C-terminal. Le domaine de kinase constitue l'interface de dimérisation cruciale pour l'activation de PKR et réalise les fonctions catalytiques de la protéine. Reliure de PKR à l'ARN double brin viral conduit à son changement de conformation permettant la dimérisation et l'auto-phosphorylation sur Thr 446 entre autres résidus. PKR produit ensuite la phosphorylation de eIF2α, bloquant ainsi la traduction des ARNm viral 23-27.
Les deux RIG-I et PKR objet d'importants réaménagements structurels, former des complexes oligomères et sont modifications post-traductionnelles par phosphorylation / déphosphorylation et ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Pour une meilleure compréhension de laquelle les structures d'ARN viral activent RIG-I et PKR (et à quel stade antagonistes virales pourraient binterférant e), il est important de déterminer avec précision l'état d'activation. Pour les deux PRRs il a été précédemment décrit que l'activation conduit à l'apparition de fragments de protéine résistant à la trypsine 6,17,30 et oligomères d'ordre supérieur 6,18,19. Toutefois, compte tenu de la richesse de la littérature sur les facteurs clés de la réponse antivirale de l'hôte 1,2,24, l'application de méthodes directes semble relativement rare. Dans l'espoir de stimuler l'utilisation plus large, nous fournissons des protocoles pratiques et sensibles pour analyser robuste les états d'activation de RIG-I et PKR. Le compétente A549 de lignée cellulaire humaine IFN est infecté par un activateur établi de RIG-I et de PKR, le virus de la fièvre de la Vallée du Rift atténué clone mutant 13 (Cl 13) 31,32. Après une procédure de lyse simple, les extraits de cellules infectées sont testés par digestion à la trypsine / ouest analyse limitée blot pour évaluer commutation de conformation, et par le bleu natif gel de polyacrylamide (PAGE) / analys Western blotest de mesurer la formation d'oligomères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Détecter la présence de virus et l'activation du type antiviral système I IFN sont cruciales pour les réponses immunitaires innées succès 22. La détection des virus est donc médiatisée par la reconnaissance des agents pathogènes récepteurs (PRR) comme RIG-I et PKR, ce qui permet une réponse rapide et l'activation des mécanismes de défense antivirale. Ici, nous décrivons deux méthodes pour évaluer directement l'état d'activation de RIG-I et de PKR.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Alejandro Brun de CISA-INIA pour fournir anti-fièvre de la vallée du Rift Virus sérums. Travail dans nos laboratoires est soutenu par Forschungsförderung bijou. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Graduate School Leibniz pour les maladies virales émergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, et la DFG Schwerpunktprogramm (PSP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
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