Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.
Anti-HIV ilaçlarının bir dizi kabul edilmiş olmasına rağmen, toksisite ve ilaç direnci ile ilgili sorunlar hala mevcuttur. Bu, en az toksisite ile ortak bir ilaç dirençli HIV-1 suşları ile enfeksiyonu önleyebilen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir ihtiyaç gösterir. Burada, hızlı hücre sitotoksisitesinin ve WT ve mutant virüs suşlarına karşı bir bileşiğin etkinliğinin belirlenmesi için kullanılabilecek etkili bir deneyi tarif eder.
Arzu edilen hedef hücre hattı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohumlanmıştır ve 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ilave edilir. Daha başka manipülasyonlar hücresel sitotoksisite deneyleri için gerekli olan; anti HIV lusiferaz hücrelere ilave edilir eksprese eden bir WT veya ilaç dirençli HIV-1 vektörü ya da bir önceden belirlenmiş miktarda deneyleri. Sitotoksisite, bir ATP bağımlı parlaklık deneyi ve enfeksiyon üzerinde bileşiklerin etkisini kullanarak ölçülür lucife miktarının belirlenmesi ile ölçülürvarlığında ya da varsayılan inhibitör yokluğunda rase.
Bu tarama deneyinde tamamlamak için 4 gün sürer ve çok sayıda bileşiğin paralel olarak taranabilir. Bileşikler üç kez taranır ve veri hedef bileşiklerin yokluğunda enfekte / ATP seviyeleri normalleştirilir. Bu teknik potansiyel anti HIV bileşiklerin etkinliği ve toksisite hızlı ve doğru ölçüm sağlar.
HIV-1 viral yaşam döngüsündeki çeşitli temel adımları hedefleyen ilaçların durumuna çok HIV-1 enfeksiyonlarının tedavisi ve uzun vadeli hayatta kalma geliştirdi kombine ilaç tedavisi (yüksek oranda aktif bir anti retroviral terapi olarak adlandırılan veya HAART) yol açmıştır Hastaların. Tipik olarak iki, nükleosid ters transkriptaz (RT) inhibitörü ve bir proteaz inhibitörü ya da bir nükleosid olmayan bir RT inhibitörü kombinasyonlarını kullanan HAART, şimdi bir yaşam boyu durum 1-5 içine ölümcül bir hastalık dönüştürülmüş bulunmaktadır. Ancak, viral replikasyonunun zaman içinde tutulan bastırılmasına içinde HAART çok başarılara rağmen, bu sınırlamaları vardır. HAART'a HIV ortadan kaldırmak değildir, bu nedenle hastalar tedavi edilmez ve tedavi hayat uzun. Ilaç toksisitesi ve ilaca dirençli suşların ortaya çıkması ile sorunlar vardır. Direnç HIV integrazın (IN) hedef yeni onaylanan ilaçlar dahil onaylı anti HIV ilaçları, tüm ortaya çıkabilir. İlaç direnci muhtemelen beca doğarViral replikasyon (3 x 10 -5 mutasyonlar / baz / çoğaltma döngüsü hata oranı) sırasında meydana gelen spontan mutasyon kullanım 6. Mutasyonlar anti-retroviral ilaç hedefleri kodlayan genlerde ortaya çıkar, bu mutasyonların küçük alt ilaçlara viral suşun duyarlılığında bir azalmaya yol açacaktır. Ilaç direncinin geliştirilmesini önlemek için, bir ilaç konsantrasyonu tam olarak HIV çoğalmasını önlemek seviyede muhafaza edilmelidir. Tedavi rejimine kötü bağlılık sorunu şiddetlendirir, ve direnç 7-9 hızlı gelişimine yol açabilir. İlaç konsantrasyonları farklı emilim, metabolizma, dağıtım, ve boşaltım seviyelere hastalarda değişebilir olmasına rağmen, yüksek ilaç konsantrasyonları toksisite 10 yol açabilir. Tedavi hastanın yaşam boyunca devam yana, anti-retroviraller uzun süreli toksisite konusunda ciddi güvenlik endişeleri vardır. HAART yaygın kullanılan anti-retroviraller olumsuz etkilere sahip olabilir and yan etkileri yaşamı tehdit 11-15 oylandı olaylar olmuştur. Hastalar direnci ve toksisite gelişimi ile karşılaşma sorunları etkili bir şekilde çok az veya hiç toksisite ile uzun süreli virüsün ortak ilaca dirençli türlerinin çoğalmasını bloke yeni ilaçlar geliştirmek için ihtiyaç altında yer alır.
Bu nedenle, hızlı bir şekilde, viral yaşam çevriminde temel adımları bloke bileşiklerin taranması için bir analiz için bir ihtiyaç vardır. Burada bir bileşikler ve hızlı ve verimli bir şekilde WT ve ilaca dirençli HIV türlerinin her ikisinin replikasyonunu bloke etme kabiliyetleri sitotoksisitesini değerlendirmek için kullanılabilecek etkili bir tahlili tarif eder. Kullandığımız deney hasta 16-18 izole virüs ilaç direnci taranması için geliştirilmiş bir deneyde benzer.
Deney HIV ters transkripsiyon engelleyebilir bileşikler için ekrana değişiklik olmadan da kullanılabilir olsa da, descri doyurmayaibe inhibitörleri IN değerlendirmek için tahlil kullanılarak. IN hücresel genom içine 19 ekler viral DNA, bir viral temel bir enzimdir. Inhibitörleri umut verici bir dizi geliştirilmektedir da, bazıları halen, sadece Isentress 20, 21 (aynı zamanda Raltegravir veya RAL olarak da bilinir), klinik denemeler sürmektedir ve son zamanlarda, Elvitegravir (EVG) 22 ve Dolutegravir (DTG) 23 olmuştur FDA tarafından onaylanmıştır. Bu bileşikler, HIV Yatak ve hücre kültüründe non-B alt tipleri hem karşı ve hastaların 24, 25 aktiftirler. Bununla birlikte, RAL ile tedavi Y143R, N155H ve G140S/Q148H 24, 26-31 de dahil olmak üzere mutantlan, IN ilaca dirençli HIV-1 için seçer. N155H ve G140S/Q148H ayrıca bu direnç mutasyonlarına karşı etkili olan iplikçik transfer inhibitörleri (INSTIs) IN ikinci nesil tasarım ve geliştirilmesi gereğini vurguluyor EVG etkinliğini azaltmak.
Biz, sitotoksisite ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 hem de replikasyonunu inhibe etme kabiliyetleri açısından bileşikleri taramak için kullanılabilecek bir hızlı, etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyi tarif eder. Hızla bileşikleri belirlemek ve etkinliğini ve sitotoksisite test etmek için yeteneği, HIV-1'e karşı, yeni ve geliştirilmiş ilaçların geliştirilmesinde önemlidir. Kurşun bileşikleri belirlendikten sonra, kurşun bileşiği analogları üretilen ve aynı deneyi kullanılarak test edilebilir. Tahlil oldukça basittir. Kullanıcının en sık karşılaşılan sorunlar (zehirli bileşikler, vektör stoku ile ilgili sorunlar) teşhis etmek için izin hem pozitif ve negatif kontroller vardır. Ilavesiz bileşiği ile kuyu, üçlü bir dizi kullanım, virüs tarafından enfeksiyon meydana geldiğini göstermektedir. Sitotoksisite bağımsız deneyde ölçülür olması viral replikasyonu üzerindeki özel bir etkisi olarak sitotoksisiteye neden lusiferaz bir azalma yanlış yorumlanması önler.
Kritik adımlarHücrelerin eşit olarak kuyu her virüsün aynı miktarda eklenmesi, ve lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi, oyuklar test edilecek bileşiklerin uygun konsantrasyonları sahip olduğu, kuyularda, dağıtılır ve böylece protokolde plakaları hazırlanıyor CC 50 ve IC 50 değerleri belirlemek.
Tahlil, kasa sayısal ve tekrarlanabilir. Vektör, replikasyon kusurlu olduğu için deney güvenlidir. Doğru ve uygun denenebilir lüsiferoz ifade eden bir tek yuvarlak vektör, dayalı olduğu için tahlil nicel ve tekrarlanabilir. Bir çok yuvarlak virüs çoğaltma tahlilinde, ölçülen IC50 viral yaşam döngüsü sayısına bağlıdır; deneyler WT ve önemli ölçüde farklı çoğaltma kapasitelerine sahip olabilir, ilaç dirençli iki virüs içeren bu bir sorundur.
Birkaç enzimatik deneyler bu olabilir orada önceden bildirilmiştirIN inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Entegre DNA ölçmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisi içeren deneyler daha emek yoğun ve 36, 37 her ikisi de pahalıdır, saflaştırılmış rekombinant protein (ler) gerektirir, ve genel olarak, bulunmaktadır. Bu, diğer viral enzimler (RT ve proteaz) üzerinde bileşiklerin etkisini ölçmek için enzimatik testleri kullanmak mümkün olsa da, her bir enzim, kendi deney sistemi gerektirir. Bir yuvarlak deney vektörü tarif edildiği gibi, RT inhibitörlerinin taranması için, değişiklik olmadan, kullanılabilir. Benzer bir deney, proteaz inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir; Bununla birlikte, bir proteaz inhibitörü deneyde, bileşikler vektörlerini üretmek için kullanılan hücrelere ilave edilmelidir. İlgili bir deney, çeşitli hücreler ve vektörler kullanılarak, aynı zamanda zarf (env) ve HIV giriş füzyon inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Son olarak, deney otomatik robot dağıtım aracı ile birlikte, daha büyük bir ölçekte, kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil, WT ve m karşı bileşiklerin büyük kütüphaneleri taramak için kullanılabilirutant HIV. Ancak, gerçek deney verileri yorumlamakta bir sınırlama viral yaşam döngüsü noktaları farklı aşamalarında hareket HIV replikasyon inhibitörü algılayabilir. Kendi başına deney, yaşam döngüsünde adım bir bileşik ile bloke edildiği tanımlamaz. Bu soru doğarsa, bu ilave tahliller 38 saati kullanılarak çözüldü ve saflaştırılmış rekombinant viral proteinlere karşı bileşiği test tarafından yapılabilir.
Ne yazık ki, anti-HIV ilaç başarıya rağmen, direnç ve toksisite hem de sorunlar hala var. Etkili bir anti-HIV aşı yokluğunda, mevcut ilaç dirençli mutantların karşı etkili olacak, ancak aynı zamanda virüsün yayılmasını azaltmak önleyici ilaçlar geliştirmek için yeni bir tedavi edici ilaçlar geliştirmek için sadece bir ihtiyaç vardır. Anti-HIV ilaçlarının profilaktik kullanımı bulaşmamış insanların tedavi incudes ise, bu yaklaşım l var olan ilaçların geliştirilmesi üzerinde özel bir yük getireceğiittle veya uzun süreli toksisite.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma NCI İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |