ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性(CC 50)を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。
抗HIV薬の番号が承認されているが、毒性および薬剤耐性の問題が依然として存在する。これは、最小限の毒性で共通の薬剤耐性HIV-1株による感染を阻害することができる新しい化合物を同定する必要性を示している。ここでは、急速にWT及び突然変異体ウイルス株に対する化合物の細胞傷害性および有効性を決定するために使用できる効率的なアッセイを記載している。
所望の標的細胞株を96ウェルプレートに播種され、24時間のインキュベーション後、試験すべき化合物の逐次希釈液を添加する。これ以上の操作は、細胞性細胞傷害アッセイのために必要ありません。抗HIVために、ルシフェラーゼを発現するWTまたは薬物耐性HIV-1ベクターを細胞に添加されるか、所定量のアッセイ。細胞毒性は、ATP依存ルミネッセンスアッセイを用いて測定され、感染性に対する化合物の影響はlucifeの量を決定することによって測定される存在または推定阻害剤の非存在下で、RASE。
このスクリーニングアッセイの完了には4日かかり、多数の化合物を並行してスクリーニングすることができる。化合物は三連でスクリーニングされ、データは、標的化合物の非存在下での感染力/ ATPレベルに対して正規化される。この技術は、潜在的な抗HIV化合物の有効性および毒性の迅速かつ正確な測定を提供する。
HIV-1ウイルスの生活環のいくつかの重要なステップを標的とする薬物の利用可能性が大幅にHIV-1感染の治療、および長期生存を改善した(高活性抗レトロウイルス療法、またはHAARTと呼ばれる)併用薬物療法につながっている患者の。典型的には2つのヌクレオシド系逆転写酵素(RT)阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシドRT阻害剤のいずれかの組み合わせを使用してHAARTは、現在、生涯条件1-5に致命的な疾患を変換した。しかし、ウイルス複製の持続抑制におけるHAARTの多くの成功にもかかわらず、それには限界がある。 HAARTは、HIVを根絶しないため、患者は治癒しないと治療が人生長いです。薬物毒性を持つと薬剤耐性株の出現には問題がある。抵抗は、HIVインテグラーゼ(IN)を対象に新たに承認された薬を含む承認された抗HIV薬、のすべてに発生する可能性があります。薬剤耐性はおそらくBECAを生じウイルス複製(3×10 -5の変異/塩基/複製サイクルの誤り率)6中に生じる自然突然変異の使用。変異が抗レトロウイルス薬のターゲットをコードする遺伝子で発生した場合、これらの変異の小さなサブセットは、薬剤へのウイルス株の感受性の減少につながる。薬剤耐性の発生を回避するために、薬物濃度は、完全にHIVの複製を抑制するレベルに維持されなければならない。治療計画への密着不良が問題を悪化させ、抵抗7-9の急速な発展につながることができます。薬物濃度が原因で、異なる吸収、代謝、分布、および排泄レベルに患者で異なりますが、高い薬物濃度は、毒性が10につながることができます。治療は、患者の生活のために続けているため、抗レトロウイルスの長期毒性について深刻な安全上の懸念がある。一般にHAARTで使用される抗レトロウイルスが有害作用を有することができるND副作用は人生は11から15を脅かしてきた発生率があった。患者が抵抗性と毒性の開発で発生する問題を効果的にほとんど、あるいは全くの長期的な毒性を持つウイルスの一般的な薬剤耐性株の複製を阻止する新薬を開発する必要性の根底にある。
これにより、迅速にウイルスの生活環に必須の手順を遮断する化合物をスクリーニングすることができるアッセイが必要とされている。ここでは、化合物および迅速かつ効率的にWTおよび薬剤耐性HIV株の両方の複製をブロックする能力の細胞毒性を評価するために使用することができる効率的なアッセイを記載している。我々が使用するアッセイは、患者16〜18から分離されたウイルスに薬剤耐性をスクリーニングするために開発されたアッセイに似ています。
アッセイは、HIV逆転写を遮断することができる化合物をスクリーニングするために改変することなく使用することができるが、我々はDESCRうIBE阻害IN評価するアッセイを使用して。 INは、細胞ゲノムへのウイルスDNA 19を挿入必須ウイルス酵素である。阻害剤で有望なの数が開発されていますが、そのうちのいくつかは現在、アイセントレス20、21(これもラルテグラビルやRALとも呼ばれます)の臨床試験を受けているし、最近では、Elvitegravirは(EVG)22とDolutegravir(DTG)23があったFDAが承認した。これらの化合物は、25 HIVおよびB細胞培養物中の患者24における非Bサブタイプの両方に対して活性である。ただし、RALを用いた治療は、薬剤耐性HIV-1変異体では、Y143R、N155H、およびG140S/Q148H 24、26〜31を含むために選択されます。 N155HとG140S/Q148Hはまた、これらの耐性変異に対して有効である鎖転移阻害剤(INSTIs)の第二世代を設計し、開発する必要性を強調しているEVGの有効性を減少させる。
我々は、細胞毒性およびWTおよび薬剤耐性HIV-1の両方の複製を阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用することができ、迅速、効率的、かつ再現可能なアッセイを記載している。迅速な化合物を同定し、それらの有効性及び細胞毒性を試験する能力は、HIV-1に対する新規かつ改良された薬物の開発に重要である。リード化合物が同定されると、リード化合物の類似体が生成され、同じアッセイを用いて試験することができる。このアッセイは、比較的簡単である。ユーザーは最も一般的な問題(毒性化合物、ベクターストックに関する問題)を診断することを可能に正と負の両方のコントロールがあります。添加していない化合物を三連のウェルのセットの使用は、ウイルス感染が発生したことを示している。細胞毒性は独立したアッセイで測定されているという事実は、ウイルス複製の特定の効果として、細胞毒性に起因するルシフェラーゼの減少を誤解避けることができます。
重要なステップ細胞が均一にウェルのそれぞれに同じ量のウイルスを加え、にルシフェラーゼ活性を測定し、ウェルを試験されるべき化合物の適切な濃度を有することを、ウェル中に分配されるようにプロトコルでプレートを準備しているCC 50およびIC 50値を決定します。
アッセイは、安全で、定量的、かつ再現性がある。ベクターが複製欠陥があるので、このアッセイは安全です。それが正確かつ簡便にアッセイすることができるルシフェラーゼを発現する単一ラウンドベクターに基づいているので、このアッセイは、定量的および再現可能である。マルチラウンドのウイルス複製アッセイにおいて、測定されたIC 50は、ウイルスのライフサイクルの数に依存する;アッセイは、WTと有意に異なる複製能力を有することができる薬剤耐性ウイルスの両方を含むとき、これは特に問題である。
いくつかの酵素アッセイはそれができ、以前にも報告されているIN阻害剤をスクリーニングするために使用される。統合されたDNAを測定するために、リアルタイムPCR技術を伴うアッセイは、より労働集約的であり、36、37高価で、精製された組換えタンパク質(複数可)を必要とし、一般的である。それは、他のウイルス酵素(RTおよびプロテアーゼ)に対する化合物の影響を測定する酵素アッセイを使用することが可能であるが、各酵素は、独自のアッセイシステムを必要とする。一周ベクターアッセイは、記載されるように、RT阻害剤をスクリーニングするために、修正することなく、使用することができる。同様のアッセイは、プロテアーゼインヒビターをスクリーニングするために使用することができる;しかしながら、プロテアーゼ阻害アッセイにおいて、化合物は、ベクターを製造するために使用される細胞に添加されなければならない。関連アッセイは、異なる細胞およびベクターを用いて、エンベロープ(ENV)及びHIV侵入融合阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。最後に、このアッセイは、自動化されたロボットのディスペンサーで、大規模に使用することができる。従って、アッセイは、WTおよびmに対する化合物の大きなライブラリーをスクリーニングするために使用することができるutant HIV。しかしながら、実際のアッセイでは、データの解釈に制限はウイルスのライフサイクルポイントの異なる段階で作用するHIV複製の阻害剤を検出することができる。単体でアッセイは、ライフサイクルのステップは化合物によりブロックされているかを定義していません。この疑問が生じた場合には、添加アッセイの38時間を使用することによって解決され、精製された組換えウイルスタンパク質に対して化合物を試験することにより得ることができる。
残念ながら、抗HIV薬の成功にもかかわらず、抵抗および毒性の両方に問題が残っています。有効な抗HIVワクチンの非存在下で、既存の薬物耐性変異体に対して有効であるだけでなく、ウイルスの拡散を低減することができる予防的な薬剤を開発するための新しい治療薬を開発するだけでなく、必要とされている。抗HIV薬の予防的使用は、感染していない人々の治療をincusの複数形の場合、このアプローチはリットルを有する薬物の開発に特別な負担を配置するittleあるいは全く長期の毒性。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、NCIの学内研究プログラムによってサポートされていました。
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |