Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.
Obwohl eine Reihe von Anti-HIV-Arzneimittel genehmigt wurden, gibt es immer noch Probleme mit der Toxizität und Medikamentenresistenz. Dies zeigt die Notwendigkeit, neue Verbindungen, die Infektion durch die gemeinsame arzneimittelresistenten HIV-1-Stämme mit minimaler Toxizität hemmen kann, zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um schnell zu bestimmen, die zelluläre Zytotoxizität und Wirksamkeit einer Verbindung gegen WT und Mutanten-Virusstämme.
Die gewünschte Zielzelllinie wird in 96-Well-Platte ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation werden seriell Verdünnungen der zu testenden Verbindungen zugegeben. Keine weitere Manipulationen sind für zelluläre Zytotoxizität-Tests erforderlich; für Anti-HIV-Tests eine vorbestimmte Menge von entweder einer WT oder arzneimittelresistenten HIV-1-Vektor, der Luciferase zu den Zellen gegeben drückt. Zytotoxizität wird unter Verwendung eines ATP-abhängige Lumineszenz-Assay und die Wirkung der Verbindungen auf die Infektiosität gemessen wird durch Bestimmen der Menge des gemessenen luciferase in Gegenwart oder Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitoren.
Diese Screening-Test dauert 4 Tage dauern und mehrere Verbindungen parallel untersucht werden. Verbindungen werden dreifach durchmustert, und die Daten sind auf die Infektiosität / ATP-Spiegel in Abwesenheit von Zielverbindungen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und genaue Messung der Wirksamkeit und Toxizität von potentiellen Anti-HIV-Verbindungen.
Die Verfügbarkeit von Medikamenten, die an einige wesentliche Schritte in der HIV-1 viralen Lebenszyklus zu Kombinationstherapie (so genannte hochaktive antiretrovirale Therapie oder HAART), die sich stark verbessert hat die Behandlung von HIV-1-Infektionen, und die langfristige Überlebensrate geführt der Patienten. HAART, die typischerweise verwendet Kombinationen von zwei Nukleosid-Reverse-Transkriptase-(RT)-Hemmer und entweder ein Protease-Inhibitor oder ein Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wurde jetzt eine tödliche Krankheit umgewandelt in ein Leben lang Zustand 1-5. Trotz der vielen Erfolge von HAART in verzögerter Unterdrückung der Virusreplikation, hat es jedoch Einschränkungen. HAART nicht auszurotten HIV, so dass die Patienten nicht geheilt und Therapie ist das Leben lang. Es gibt Probleme mit Medikamententoxizität und mit der Entstehung von resistenten Sorten. Widerstand kann auf alle zugelassenen Anti-HIV-Medikamente, einschließlich der neu zugelassenen Medikamente, die HIV-Integrase (IN) Ziel kommen. Arzneimittelresistenz entsteht wahrscheinlich becaVerwendung von spontanen Mutationen, die während der viralen Replikation (Fehlerrate von 3 x 10 -5 Mutationen / base / Replikationszyklus) auftreten 6. Wenn Mutationen entstehen in den Genen, die für die Ziele der Anti retrovirale Medikamente codiert, wird eine kleine Teilmenge dieser Mutationen zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Virusstammes, um die Medikamente führen. Um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden, muss Wirkstoffkonzentrationen auf einem Niveau, das die HIV-Replikation vollständig zu unterdrücken, aufrecht erhalten werden. Schlechte Einhaltung der Therapieregime verschärft das Problem, und kann auf die schnelle Entwicklung von Resistenzen führen 7-9. Obwohl Wirkstoffkonzentrationen bei Patienten aufgrund unterschiedlicher Resorption, Stoffwechsel, Verteilung und Ausscheidung Ebenen variieren können hohe Wirkstoffkonzentrationen, um die Toxizität 10 führen. Seit Therapie weiterhin für das Leben des Patienten, gibt es ernsthafte Sicherheitsbedenken hinsichtlich der langfristigen Toxizität von Antiretroviren. Die antiretrovirale Medikamente häufig in HAART verwendet werden, können negative Auswirkungen haben einnd gab es Fälle, wo die Nebenwirkungen wurden lebensbedrohlich 11-15. Die Probleme, die Patienten stoßen mit der Entwicklung von Widerstand und Toxizität zugrunde liegen, die Notwendigkeit, neue Medikamente, die die Replikation der gemeinsamen resistenten Stämme des Virus mit wenig oder keine langfristige Toxizität effektiv blockieren zu entwickeln.
Somit besteht ein Bedarf an einem Assay, der für die Verbindungen, die wesentlichen Schritte schnell blockieren im viralen Lebenszyklus zu screenen kann. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um die Zytotoxizität der Verbindungen A und ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und Arzneimittel-resistente HIV-Stämme schnell und effizient zu blockieren auszuwerten. Der Test wir verwenden, ist ähnlich zu einem Test, der entwickelt wurde, um für eine Arzneimittelresistenz in Virus aus Patienten isoliert 16-18 screenen.
Obwohl der Test kann ohne Modifikation zum Screening auf Verbindungen, die HIV reverse Transkription blockieren kann verwendet werden, werden wir describe mit dem Test zu bewerten, IN-Inhibitoren. IN ist ein essentielles virales Enzym, das die virale DNA in das zelluläre Genom 19 einfügt. Obwohl eine Reihe von vielversprechenden IN Inhibitoren entwickelt werden, von denen einige derzeit in klinischen Studien nur Isentress 20, 21 (auch als Raltegravir oder RAL bekannt) und in jüngerer Zeit, Elvitegravir (EVG) 22 und Dolutegravir (DTG) 23 wurden von der FDA zugelassen. Diese Verbindungen sind sowohl gegen HIV-B-B-Subtypen und nicht in Zellkultur und in Patienten 24, 25 aktiv. Die Behandlung mit RAL wählt für Arzneimittel-resistente HIV-1-IN-Mutanten, einschließlich Y143R, N155H und G140S/Q148H 24, 26-31. N155H G140S/Q148H und reduzieren auch die Wirksamkeit von EVG, die die Notwendigkeit, IN Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die wirksam gegen diese Resistenz-Mutationen sind Design und Entwicklung der zweiten Generation betont.
Wir beschreiben eine schnelle, effiziente und reproduzierbare Assay zum Screening von Verbindungen, die für die Zytotoxizität und auf ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und arzneimittelresistenten HIV-1 hemmen, verwendet werden können. Die Fähigkeit, schnell Verbindungen zu identifizieren und prüfen ihre Wirksamkeit und Zytotoxizität bei der Entwicklung von neuen und verbesserten Arzneimitteln gegen HIV-1 wichtig. Sobald Bleiverbindungen identifiziert werden, können Analoga der Bleiverbindung hergestellt werden und unter Verwendung des gleichen Assays. Der Test ist relativ einfach. Es gibt sowohl positive und negative Kontrollen, die dem Benutzer die häufigsten Probleme (toxische Verbindungen, Probleme mit dem Vektor stock) Diagnose zu ermöglichen. Die Verwendung eines Dreifachsatzes von Vertiefungen ohne zugesetzte Verbindung zeigt, dass die Virusinfektion aufgetreten. Die Tatsache, dass die Cytotoxizität in einem unabhängigen Test gemessen vermeidet Fehlinterpretation einer Verringerung der Luciferase von Zytotoxizität als eine spezifische Wirkung auf die virale Replikation verursacht werden.
Die kritischen Schrittein dem Protokoll werden die Platten vorbereitet, so dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind, daß die Bohrungen über die entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen, indem die gleiche Menge an Virus zu jeder der Vertiefungen, und die Messung der Luciferase-Aktivität Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte.
Der Test ist sicher, quantitative und reproduzierbar. Der Test ist sicher, weil der Vektor-Replikation defekt. Der Test ist quantitativ und reproduzierbar, da sie auf einer einzigen Runde Vektor, der Luciferase exprimiert, die genau und bequem untersucht werden kann, nach. In einer mehrjährig Virusreplikation Assay wird die gemessene IC 50 hängt von der Anzahl der viralen Lebenszyklen; dies ist ein besonderes Problem, wenn die Tests umfassen sowohl WT und resistenten Viren, die deutlich unterschiedliche Replikations Kapazitäten haben können.
Es wurden mehrere enzymatische Tests zuvor berichtet, dassverwendet werden, um an Inhibitoren screenen. Assays, die Echtzeit-PCR-Technologie beinhalten, um integrierte DNA messen erfordern gereinigt rekombinante Proteine (e) und sind in der Regel sowohl arbeitsintensiv und teuer 36, 37. Obwohl es möglich ist, die enzymatische Assays verwenden, um die Wirkung der Verbindungen auf die andere virale Enzyme (RT und Protease) zu messen, wobei jedes Enzym erfordert eine eigene Testsystem. Die eine Runde Vektor-Assay wie beschrieben, kann verwendet werden, ohne Änderung an für RT-Inhibitoren zu screenen. Ein ähnlicher Test kann verwendet werden, um Protease-Inhibitoren zu screenen; jedoch in einem Protease-Inhibitor-Assay, die Verbindungen müssen auf die die Vektoren verwendet Zellen hinzugefügt werden. Eine verwandte Assay mit verschiedenen Zellen und Vektoren können auch verwendet werden, um Umschlag (env) und das Eindringen von HIV-Fusionsinhibitoren screenen. Schließlich kann der Assay verwendet werden, in einem größeren Maßstab, mit automatisierten Roboterspendern. So kann der Assay verwendet werden, um große Bibliotheken von Verbindungen gegen WT und m screenenutant HIV. Die Tatsache jedoch, kann der Assay einen Inhibitor der HIV-Replikation, die in verschiedenen Stadien des viralen Lebenszyklus weist auf eine Beschränkung in der Interpretation der Daten wirkt, zu erfassen. Von selbst der Test wird nicht definiert, welcher Schritt im Lebenszyklus durch eine Verbindung blockiert. Wenn diese Frage stellt, kann es durch Verwendung der Zeit des Assays zusätzlich 38 gelöst werden, und durch Testen der Verbindung gegen gereinigten rekombinanten viralen Proteinen.
Leider trotz des Erfolgs der Anti-HIV-Arzneimittel, gibt es immer noch Probleme mit sowohl Beständigkeit und Toxizität. In Abwesenheit einer wirksamen Anti-HIV-Impfstoff, ist es notwendig, nicht nur neue therapeutische Arzneimittel, die wirksam sein werden anhand der vorhandenen Arzneimittel-resistenten Mutanten, sondern auch zu prophylaktischen Medikamente, die die Ausbreitung des Virus zu reduzieren entwickeln zu entwickeln. Wenn die prophylaktische Anwendung von Anti-HIV-Medikamente incudes die Behandlung von nicht-infizierten Menschen wird dieser Ansatz eine besondere Belastung für die Entwicklung von Medikamenten, haben l sind platzierenittle oder keine langfristige Toxizität.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NCI unterstützt.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |