Здесь мы опишем клеточную цитотоксичность и один раунд анализы инфекционности, которые позволяют для быстрого и точного скрининга соединений с целью определения их клеточную цитотоксичность (CC 50) и значения ИК 50 против WT и прочной ВИЧ-1 препарата.
Хотя ряд анти лекарств против ВИЧ были одобрены, все еще существуют проблемы с токсичностью и лекарственной устойчивости. Это показывает необходимость идентификации новых соединений, которые могут ингибировать инфекцию общими лекарственной устойчивостью штаммов ВИЧ-1 с минимальной токсичностью. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для быстрого определения клеточной цитотоксичности и эффективность соединения против дикого типа и мутантных штаммов вируса.
Желаемый целевой линии клеток высевали в 96-луночный планшет с и после 24 ч инкубации последовательно разведения тестируемых соединений добавлены. Никаких дополнительных манипуляций не требуется для сотовых цитотоксичность; для анти ВИЧ анализах заранее определенное количество либо WT или лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 вектора, который экспрессирует люциферазы добавляют к клеткам. Цитотоксичность измеряется с помощью АТФ зависимую люминесценции анализа и воздействие соединений на инфекционность измеряется определением количества lucifeRase в присутствии или в отсутствие предполагаемых ингибиторов.
Этот скрининг анализ занимает 4 дня, чтобы закончить и несколько соединения могут быть подвергнуты скринингу параллельно. Проводили скрининг соединений в трех экземплярах и данные нормированы на уровнях инфективность / СПС в отсутствии целевых соединений. Эта техника обеспечивает быстрое и точное измерение эффективности и токсичности потенциальных анти соединений ВИЧ.
Наличие препаратов, ориентированных на несколько важных шагов в ВИЧ-1 жизненного цикла вируса привело к комбинированной лекарственной терапии (так называемый высокую активность антиретровирусная терапия, или ВААРТ), что позволило значительно улучшить лечение ВИЧ-1 инфекции, а также долгосрочное выживание пациентов. ВААРТ, которая обычно использует комбинации двух нуклеозидов обратной транскриптазы (RT) ингибиторов и либо ингибитор протеазы или не ингибитора РТ нуклеозид, в настоящее время преобразован смертельную болезнь, в длинной жизни состоянии 1-5. Однако, несмотря на многочисленные успехи ВААРТ в устойчивой подавления вирусной репликации, он имеет свои ограничения. ВААРТ не искореняет ВИЧ, поэтому пациенты не излечиваются и терапия длительный срок. Есть проблемы с наркотиками токсичности и с появлением штаммов устойчивы наркотиков. Сопротивление может возникнуть для всех утвержденных анти лекарств против ВИЧ, в том числе новых утвержденных препаратов, предназначенных ВИЧ интегразы (ПО). Лекарственная устойчивость всего возникает BECAиспользование спонтанных мутаций, которые происходят во вирусной репликации (скорость погрешность 3 х 10 цикла -5 мутации / база / репликации) 6. Когда мутации возникают в генах, кодирующих мишеней анти ретровирусов, небольшая часть этих мутаций приведет к снижению восприимчивости вирусного штамма к препаратам. Чтобы избежать развития лекарственной устойчивости, концентрации препарата должна поддерживаться на уровне, который полностью подавляют репликацию ВИЧ. Несоблюдение лечебного режима усугубляет проблему, и может привести к быстрому развитию резистентности 7-9. Хотя концентрации препарата может варьироваться у пациентов из-за отличающейся поглощения, обмена веществ, распределения и уровней экскреции, высокие концентрации препарата может привести к токсичности 10. Поскольку терапия продолжается в течение жизни пациента, существуют серьезные проблемы безопасности о долгосрочной токсичности анти retrovirals. Анти retrovirals, обычно используемые в ВААРТ может иметь неблагоприятные последствияй были случаи, когда побочные эффекты были опасными для жизни 11-15. Проблемы пациентов сталкиваются с развитием резистентности и токсичности объясняют необходимость разработки новых лекарств, которые эффективно блокируют репликацию общих лекарствам штаммов вируса практически без долгосрочного токсичности.
Таким образом, существует потребность в анализе, который может скрининга соединений, которые блокируют основные этапы в жизненном цикле вируса быстро. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для оценки цитотоксичности в соединений и их способностью блокировать репликацию как дикого типа и штаммов ВИЧ с лекарственной устойчивостью быстро и эффективно. Анализ мы используем похож на анализе, который был разработан для выявления лекарственной устойчивости вируса, выделенного у больных 16-18.
Хотя анализ может быть использован без модификации для скрининга соединений, которые могут блокировать обратную транскрипцию ВИЧ, мы будем DescrМБП с использованием анализа для оценки В ингибиторы. В является важным вирусный фермент, который вставляет вирусной ДНК в клеточный геном 19. Хотя ряд перспективных в ингибиторов в настоящее время разрабатываются, некоторые из которых в настоящее время проходят клинические испытания, только Isentress 20, 21 (также известный как Ралтегравир или RAL) и совсем недавно, элвитегравира (ГО) 22 и Dolutegravir (DTG) 23 закончились утвержден FDA. Эти соединения являются активными и против ВИЧ B и не являющихся B подтипов в клеточной культуре и больных 24, 25. Однако лечение RAL выбирает для лекарственно-устойчивого ВИЧ-1 у мутантов, в том числе Y143R, N155H и G140S/Q148H 24 26-31. N155H и G140S/Q148H также снизить эффективность EVG, и это подчеркивает необходимость проектирования и разработки второго поколения в ингибиторов переноса цепи (INSTIs), которые являются эффективными против этих мутаций резистентности.
Опишем быстрый, эффективный и воспроизводимый анализ, который может быть использован для скрининга соединений на цитотоксичность и для их способности ингибировать репликацию как WT и прочной ВИЧ-1 препарата. Способность быстро идентификации соединений и проверить их эффективность и цитотоксичность имеет решающее значение в развитии новых и улучшенных препаратов против ВИЧ-1. После соединения свинца идентифицированы, аналоги соединения свинца могут быть изготовлены и испытаны с использованием того же анализа. Анализ является относительно простым. Есть как положительные, так и отрицательные элементы управления, которые позволяют пользователю диагностировать наиболее распространенные проблемы (токсических соединений, проблемы с вектором складе). Использование трех экземплярах множества скважин без добавления соединения показывает, что вирусная инфекция произошла. Тот факт, что цитотоксичность измеряется в качестве независимого анализа избегает неправильной интерпретации снижение люциферазы, вызванного цитотоксичности в качестве специфического эффекта на вирусную репликацию.
Критические шагив протоколе готовят пластины таким образом, что клетки равномерно распределены в лунках, что скважины иметь соответствующие концентраций тестируемых соединений, добавляя такое же количество вируса в каждой из лунок, и измерения активности люциферазы в определить CC 50 и IC 50 значения.
Анализ является безопасным, количественный, и воспроизводимым. Анализ безопасно, потому что вектор является репликация неисправен. Анализ количественный и воспроизводимым, поскольку она основана на одном круглого вектора, который экспрессирует люциферазы, который может быть оценена точно и удобно. В нескольких круглого анализа в репликации вируса, измеренная ИК 50 зависит от количества вирусных жизненных циклов; это особая проблема, когда анализы включают в себя как WT и лекарственной устойчивостью вирусов, которые могут иметь значительно различные возможности репликации.
Там было несколько ферментативные анализы сообщалось ранее, что можетбыть использованы для выявления ингибиторов в. Анализы, которые включают в реальном времени технологию PCR для измерения интегрированную ДНК требуют очищенные рекомбинантные белки (ы), и, в общем, и более трудоемким и дорогим 36, 37. Хотя можно использовать ферментативные анализы для измерения воздействия соединений на других вирусных ферментов (RT и протеазы), каждый фермент требует свою собственную систему анализа. Один круглый вектор анализ, как описано, может быть использован, без изменений, для скрининга ингибиторов обратной транскриптазы. Аналогичный анализ может быть использован для скрининга ингибиторов протеазы; Однако в ингибитора протеазы анализе соединения должны быть добавлены к клеткам, используемых для получения векторов. Связанных анализ, используя различные клетки и векторы, также могут быть использованы для выявления конверте (ENV) и ингибиторов запись слияния ВИЧ. Наконец, анализ может быть использован, в увеличенном масштабе, с роботизированные распылителей. Таким образом, анализ может быть использован для скрининга больших библиотек соединений против дикого типа и мutant ВИЧ. Однако тот факт, анализ может обнаружить ингибитор репликации ВИЧ, который действует на разных стадиях вирусных точек жизненного цикла до ограничения в интерпретации данных. Сам по себе анализ не определяет, какой этап в жизненном цикле заблокирован соединения. Если возникает вопрос, она может быть решена с помощью время добавления анализов 38, и путем проверки соединение от очищенных рекомбинантных вирусных белков.
К сожалению, несмотря на успех анти лекарств против ВИЧ, есть еще проблемы и с сопротивлением и токсичности. В отсутствие эффективного противотанкового вакцины против ВИЧ, существует необходимость не только для разработки новых терапевтических препаратов, которые будут эффективны против существующих устойчивых мутантов наркотиков, но и для развития профилактических препаратов, которые могут уменьшить распространение вируса. Если профилактическое применение анти лекарств против ВИЧ incudes лечение неинфицированных людей, этот подход будет уделять особое бремя на разработке препаратов, которые имеют лIttle или нет долгосрочный токсичность.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано исследовательской программы Интрамурального от NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |