Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.
Introduction
Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año 1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae 4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomática y oportuno diagnóstico puede permitir la intervención terapéutica para evitar el deterioro del hígado. El tratamiento actual es subóptimo y no se dispone de vacuna 5,6.
La etiología de la hepatitis C fue descrita por primera vez en 1989 7. Estudiar la replicación del VHC es importante para la vacuna contra la hepatitis C y la investigación del tratamiento, pero había sidolargo obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo viral eficiente. Un clon molecular del VHC ha demostrado ser infecciosa en los chimpancés a la inoculación intrahepática 8. Posteriormente, replicones del VHC sub-genómicas se describen, lo que permitió a diseccionar la etapa de la replicación del genoma viral en un 9,10 sistema de cultivo celular. El descubrimiento de un VHC genotipo 2 bis aislar JFH-1 (hepatitis fulminante-1 japonés), capaz de infectar un cultivo celular abierto nuevas vías para la investigación la replicación del VHC 11-13. Cepa del genotipo 2 bis JFH-1 basada virus quiméricos inter e intra-genotípica y el genotipo 1 del VHC sistemas de cultivo basados infecciosas son disponibles también 14-18.
Hemos utilizado con éxito JFH-1 cepa y VHC intragenotype 2a virus quimérico obtener el mapa de alta resolución del perfil funcional de los dominios de la proteína y cis-elementos que actúan de ARN 19,20. De acuerdo con esto, aquí se describe un sistema de cultivo eficaz utilizado rutinariamente que permiteel estudio de las diversas etapas del ciclo de replicación del VHC y la interacción huésped-patógeno. Presentamos los ensayos virológicos para evaluar la replicación del genoma viral y la infectividad de novo de intragenotype VHC 2a y un reportero de VHC basado en la luciferasa de Renilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente 11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
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