Протокол для анализа вируса гепатита С репликации
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Вирус гепатита С (HCV) влияет 3% населения мира и вызывает серьезные заболевания печени, включая хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярной карциномы. ВГС оболочечным РНК вируса, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Современное лечение не полностью эффективными и вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Там нет ВГС вакцина. Таким образом, по-прежнему требуются усилия для разработки вакцины и лучшую терапию. Система HCV культуры клеток имеет решающее значение для изучения различных стадий роста ВГС в том числе вирусного входа, репликации генома, упаковки и выхода. В текущей процедуры, представленной мы использовали дикого типа intragenotype 2а химерный вирус, FNX-HCV, и рекомбинантный вирус FNX-Rluc, несущий ген-репортер люциферазы Renilla изучать репликацию вируса. Клеточной линии гепатомы человека (Хух-7 на основе) был использован для трансфекции в пробирке транскрипции ВГС геномных РНК. Бесклеточные супернатанты культуры, белковые лизаты и тг о РНК собирали в разное время указывает после трансфекции для оценки роста HCV. HCV геном состояние репликации оценивали путем количественного RT-PCR и визуализации на присутствие вируса гепатита двухцепочечной РНК. Экспрессии белка ВГС была проверена Вестерн-блот и иммунофлюоресценции анализов с помощью антител, специфичных для HCV NS3 и NS5A белков. РНК ВГС трансфицированные клетки выпущенные инфекционных частиц в культуральном супернатанте и титра вируса была измерена. Люциферазы анализы были использованы для оценки уровня репликации и инфекционность репортера ВГС. В заключение приведем различные вирусологических анализов для характеристики различных этапов цикла репликации ВГС.
Introduction
Вирус гепатита С (HCV) вызывает цирроз печени и рак печени. Это влияет 170 миллионов человек во всем мире с 350 000 человек умирают ежегодно 1-3. ВГС является положительным нить РНК вируса с размером генома 9,6 кб. Геном HCV переводится как единое полипротеина ~ 3000 аминокислотных остатков, который протеолитически расщеплен на различных клеточных и вирусных протеаз в 10 полипептидов. ВГС является вирус прототип в род Hepacivirus и принадлежит к семейству Flaviviridae 4. Под воздействием, ВГС устанавливает хронической инфекции в 80% лиц. Инфекция в основном бессимптомно и своевременная диагностика может позволить терапевтического вмешательства, чтобы предотвратить ухудшение печени. Современное лечение не является оптимальным и ни одна вакцина не доступна 5,6.
Этиология гепатита С был впервые описан в 1989 7. Изучение репликацию ВГС важно для гепатита С вакцины и научных исследований лечения, но это былодолго сдерживается отсутствием эффективной вирусной системе культуры. Молекулярный клон ВГС было показано, что инфекционное у шимпанзе на внутрипеченочного прививки 8. Впоследствии ВГС суб-геномные репликоны были описаны, что позволило вскрыть вирусную сцену геном репликации в системе культуры клеток 9,10. Обнаружение генотип 2а ВГС изолировать JFH-1 (японский Молниеносный гепатит-1), способны инфицировать культуры клеток открывает новые возможности для исследования репликации ВГС 11-13. Штамм Генотип 2а JFH-1 на основе меж-и внутри-генотипических химерные вирусы и генотип 1 HCV инфекционные системы культуры, основанной также доступны 14-18.
Мы успешно использовали JFH-1 напряжение и ВГС intragenotype 2а химерный вирус для получения высокого разрешения функциональной профилирования карту белковых доменов и цис-действующих РНК элементов 19,20. В соответствии с этим здесь мы опишем эффективную систему культуры, используемую обычно, что позволяетизучения различных этапов цикла репликации ВГС и хост-возбудителя взаимодействия. Мы представляем вирусологических анализов для оценки вирусной репликации генома и De Novo инфекционность intragenotype 2а ВГС и Renilla люциферазы журналистом ВГС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта иллюстрация описывает способ анализа цикл репликации вируса гепатита С. ВГС является человеческий патоген, и предписанная протокол биобезопасности должны быть строго соблюдены. Инфекционные системы HCV клеток культуры были описаны ранее 11-13,16,17. Есть несколько важных моменто…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
