פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.
Introduction
וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה 1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של 4 Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין 5,6.
אטיולוגיה של הפטיטיס C תוארה לראשונה בשינה 1989 7. לימוד שכפול HCV חשוב לחיסון הצהבת מסוג C ומחקר טיפול, אבל זה היההקשו עוד על ידי חוסר של מערכת תרבות ויראלי יעילה. שיבוט מולקולרי של HCV הוצג להיות מידבק שבימפנזים על חיסון intrahepatic 8. בהמשך לכך, replicons HCV תת גנומי תוארו, שאיפשר לנתח את שלב שכפול הגנום הנגיפי ב9,10 מערכת תרבית תאים. גילוי של HCV גנוטיפ 2 א לבודד JFH-1 (הפטיטיס-1 המוחלט של התפקודי היפני), מסוגל להדביק תא תרבות פתח אפיקים חדשים למחקר שכפול HCV 11-13. מתח 2a גנוטיפ JFH-1 וירוסי chimeric בין ותוך genotypic וHCV גנוטיפ 1 מערכות מבוססות תרבות זיהומיות המבוססות זמינות גם כן 14-18.
אנחנו השתמשנו בהצלחה זן JFH-1 ווירוס chimeric 2a intragenotype HCV לך את מפת האפיון פונקציונלי ברזולוציה הגבוהה של תחומים חלבון וcis-מתנהגים אלמנטים RNA 19,20. לפי זה, כאן אנו מתארים מערכת תרבות יעילה בשימוש באופן שיגרתי המאפשרתלומד שלבים שונים של מחזור שכפול HCV והאינטראקציה המאכסן לפתוגן. אנו מציגים מבחני virological להעריך שכפול הגנום נגיפי וinfectivity נובו דה של HCV 2a intragenotype וHCV כתב מבוסס לוציפראז Renilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר 11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
