C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
C 형 간염 바이러스 (HCV)는 세계 인구의 3 %에 영향을 미치는 만성 간염, 간경변 및 간암 등의 심각한 간 질환의 원인이됩니다. HCV는 가족 플라 비 바이러스과에 속하는 포락선 RNA 바이러스이다. 현재의 치료는 완전히 효과가없고, 부작용이 발생합니다. 가능한 HCV 백신이 없습니다. 따라서, 지속적인 노력은 백신과 더 나은 치료를 개발하기 위해 필요합니다. HCV 세포 배양 시스템은 바이러스 진입, 게놈 복제, 포장, 및 송신을 포함하여 HCV 성장의 각종 단계 연구에 중요하다. 제시된 현재 프로 시저에서, 우리는 야생형 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 바이러스 복제를 연구하는 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 유전자를 운반하는 재조합 FNX-Rluc 바이러스를 사용했습니다. 인간 간암 세포주 (허-7을 기준으로)의 시험 관내 형질 도입에 사용 된은 HCV 게놈 RNA를 전사를. 무 세포 배양 상층 액, 단백질 해물과 t전 체 RNA는 HCV의 성장을 평가하는 사후 형질 포인트는 다양한 시간에 수확. HCV 게놈의 복제 상태 정량적 RT-PCR 및 HCV의 존재를 시각화하는 이중 가닥 RNA에 의해 평가 하였다. HCV 단백질 발현은 HCV NS3 및 NS5A 단백질에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역 형광 분석에 의해 확인되었다. 배양 상청 및 바이러스 역가에 감염성 입자를 방출 HCV의 RNA 형질 감염 세포를 측정 하였다. 루시페라아제 리포터 분석법은 HCV의 복제 수준 및 감염성을 평가하기 위해 사용되었다. 결론적으로, 우리는 HCV의 복제주기의 다른 단계를 특성화하기위한 다양한 바이러스 적 분석을 제시한다.
Introduction
C 형 간염 바이러스 (HCV)는 간경변과 간암의 원인이됩니다. 그것은 350,000의 사람들이 매년 1-3 죽어과 170 만명이 전 세계적으로 영향을 미칩니다. HCV는 9.6 KB의 게놈의 크기와 양의 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈은 단백질 가수 분해 10 폴리펩티드에 다양한 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단된다 ~ 3000 개의 아미노산의 단일 폴리 단백질로 번역된다. HCV는 속 Hepacivirus에 프로토 타입 바이러스와 가족 플라 비 바이러스과 4에 속한다. 노출되면, HCV는 개인의 80 %에 만성 감염을 설정합니다. 감염이 진단은 간 저하를 방지하기 위해 치료 적 개입을 허용 할 수 있습니다 대부분 증상이 적시에 있습니다. 현재 치료는 차선이고 백신은 5,6 사용할 수 없습니다.
C 형 간염의 원인은 1989 7 설명했다. HCV 복제를 공부하는 것은 C 형 간염 백신과 치료 연구를위한 중요하지만이 있었다긴 효율적인 바이러스 배양 시스템의 부족에 의해 방해. HCV의 분자 클론은 간내 접종 8시 침팬지에 감염 될 것으로 나타났다. 이어서, HCV 서브 게놈 플리은 세포 배양 시스템 9,10에서 바이러스 게놈 복제 단계를 절개 할 수있는 기술되었다. 유전자형 2A의 HCV의 발견은 JFH-1 (일본어 전격 성 간염 1) 분리, 세포 배양을 감염시킬 수는 HCV의 복제 연구를 11 ~ 13를위한 새로운 길을 열었습니다. 유전자형 2A 변형 JFH-1 간 및 내 유전자형 키메라 바이러스와 유전자형 1 HCV 기반 기반 감염성 문화 시스템뿐만 아니라 14 ~ 18 사용할 수 있습니다.
우리는 성공적으로 단백질 도메인 및 시스 – 작용하는 RNA 요소 (19, 20)의 고해상도 기능 프로파일의지도를 구하는 것이 JFH-1 균주 및 HCV의 intragenotype의 2A 키메라 바이러스를 사용했습니다. 이 기사에 따르면, 우리가 할 수 일상적으로 사용하는 효과적인 문화 시스템을 설명HCV의 복제주기 및 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 단계를 공부. 우리는 바이러스 게놈 복제 및 intragenotype 2a 개의 HCV와 레 닐라 루시퍼 기반 기자 HCV의 새로이 감염을 평가 한 바이러스 분석을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 그림은 C 형 간염 바이러스의 복제 사이클을 분석하는 방법을 설명한다. HCV는 인간의 병원체이며, 소정의 바이오 안전성 의정서는 엄격하게 준수해야하는 것입니다. HCV 감염 세포 배양 시스템은 이전 11-13,16,17 설명되었다. 예시 된 프로토콜을 다음과 같은 때 우리가 구현하는 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 다운 스트림 연구에 그대로 전체 길이 바이러스 게놈 RNA의 좋은 품?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
