Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.
Crio-tomografia de electrões é uma ferramenta poderosa na biologia estrutural, capaz de visualizar a estrutura tridimensional de amostras biológicas, tais como células, organitos, vesículas de membrana, ou vírus em detalhe molecular. Para conseguir isso, a amostra aquosa é rapidamente vitrificados em etano líquido, que preserva-lo em um estado congelado hidratado close-to-natal. Ao microscópio eletrônico, série de inclinação são registrados à temperatura do azoto líquido, a partir do qual tomografias 3D são reconstruídos. A razão sinal-para-ruído do volume tomográfico é inerentemente baixa. Reconhecível, características recorrentes são reforçadas por média subtomogram, pelo qual subvolumes individuais são cortados, alinhados e média para reduzir o ruído. Desta forma, 3D mapeia com uma resolução de 2 nm ou melhor pode ser obtida. Um ajuste de estruturas de alta resolução disponíveis para o volume 3D, em seguida, produz modelos atômicos de complexos de proteínas em seu ambiente nativo. Aqui nós mostramos como usamos elétron crio-tomography para estudar a organização in situ de grandes complexos de proteínas de membrana de mitocôndrias. Nós descobrimos que as sintases de ATP são organizadas em filas ao longo de dímeros ápices altamente curvas da cristas membrana interna, ao passo que o complexo I está distribuído de forma aleatória nas regiões da membrana de cada lado das filas. Por subtomogram média obtivemos uma estrutura da ATP sintase mitocondrial dímero dentro da membrana de cristas.
As mitocôndrias são o poder de casas da célula. Através da conversão de um gradiente de protões electroquímico através da membrana mitocondrial interna na energia de ligação química, o ATP sintase mitocondrial produz a maior parte do ATP que impulsiona os processos celulares. A fim de compreender os mecanismos por trás de conversão de energia mitocondrial, precisamos determinar a estrutura da ATP sintase in situ, e para saber como ele é organizado e distribuído na membrana mitocondrial interna. Embora as estruturas de alta resolução da maior parte dos componentes da sintase ATP mitocondrial de 1-3 e mapas de baixa resolução de todo o complexo de 4 estão disponíveis, é importante estabelecer a estrutura e a conformação da enzima activa na membrana. A distribuição da ATP sintase, na membrana mitocondrial interna tem sido amplamente consideradas como aleatória, mas um início encontrando 5 e os nossos próprios resultados iniciais indicaram que 6 isto não é tele caso. Estudos subsequentes do nosso grupo e outros 7 confirmaram que o ATP sintase é disposta em linhas longas de dímeros ao longo das nervuras curvas de força nas cristas da membrana mitocondrial interna 8, enquanto que as bombas de protões na cadeia de transporte de electrões parece estar localizado em ambos os lados das linhas 9. Este arranjo tem implicações importantes para os mecanismos de conversão de energia mitocondrial.
A técnica que usamos para determinar esse arranjo é elétron crio-tomografia (crio-ET). Cryo-ET é atualmente o único método que oferece tridimensional (3D) volumes precisos de células, compartimentos celulares ou organelas na resolução molecular. Cryo-ET é particularmente adequado para o estudo de grandes complexos de membranas biológicas, pois as membranas aparecem com bom contraste e são fáceis de localizar em volumes tomográficos 3D.
Outros métodos para estudar a estrutura 3D de células ou organelles não fornecer detalhes molecular. Super-resolução microscopia de luz 10, 11 é excelente em revelar a posição ou a distância entre marcadores emissores de luz ligados a proteínas de interesse com uma precisão de dezenas de nm, mas não revela a estrutura da própria proteína, mesmo em baixa resolução . Microscopia eletrônica de transmissão de cortes seriados de 12 ou de imagem de bloco-face por microscopia eletrônica de varredura 13 de amostras biológicas de plástico incorporado proporcionam vistas de baixa resolução de volumes celulares, mas também não revelam detalhes molecular. Microscopia de força atômica 14 pode, em princípio, oferecer resolução molecular ou mesmo atômico, mas apenas na superfície dos objetos sobre um suporte atomicamente plana e sólida. Finalmente, a tomografia de raios X ou dispersão de 15 impulsos de raios-X a partir de lasers intensos de electrões livres é improvável para revelar a estrutura de grandes complexos, objectos aperiódicos tais como células completas ou organelos no m 16resolução olecular no futuro previsível. Assim, no momento, não há alternativa a Cryo-ET para estudos da estrutura 3D de células ou organelas com resolução nanométrica.
Cryo-ET é o método de escolha para a análise da estrutura e a conformação dos conjuntos de proteínas associadas à membrana, incluindo o complexo do poro nuclear 17, a espiga 18 da gripe complexos, e os flagelos proteínas de motor 22, 23 mas também a organização das células bacterianas inteiras 19 e a entrada de vírus patogénicos tais como o VIH em células de 20-23. Cryo-ET é inestimável para a visualização de proteínas filamentosas e suas interações na célula, incluindo os filamentos de actina 24 ou axonemas 25. A resolução pode ser aumentada para 2 nm ou melhor, pela subtomogram média de 26, segundo o qual subvolumes de repetidas, feições regulares são cortadas de um volume tomográfica e média por partícula única imagem protécnicas cessamento.
Cryo-ET envolve a aquisição de uma série de imagens de projeção de uma amostra fina (<250 nm) tomadas em diferentes ângulos de inclinação em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). A amostra deve ser fina para que os elétrons, que interagem fortemente com a matéria, estão espalhados por mais de uma vez. Espalhamento múltiplo faz com que as imagens resultantes de difícil interpretação e reduz o contraste. Imagens da área da amostra seleccionada estão alinhadas umas em relação às outras e projectado para um espaço 3D por um programa de computador apropriado, gerando um volume 3D do espécime. O alinhamento das imagens é auxiliada por marcadores fiduciais de ouro, os quais são misturados com a amostra antes da congelação. Idealmente marcadores fiduciais 10 ou mais uniformemente distribuídas deve estar presente em cada imagem para obter um bom alinhamento.
Para observar detalhes molecular, as amostras são mergulhar congelado em etano líquido, que preserva seu estado hidratado nativa. Congelamento em líquidoetano é tão rápido (~ 10 5 ° C / s) 27 que a água não se cristalizam, mas permanece em um estado como vidro vitrificado. Cristal de gelo danos formação de estruturas biológicas sensíveis. Como amostras biológicas sofrem de danos por radiação, há um limite para o número total de eventos de dispersão da amostra pode tolerar. As imagens são, assim, adquirido no modo de baixa dose: Uma área de interesse é identificado com pequeno aumento (1,500X) com uma dose de elétrons abaixo de 1 e – / nm 2 (modo de busca). A imagem é focalizada em uma ampliação maior, fora da área de interesse (modo de focagem). Só quando uma imagem é adquirida, a área de interesse, é irradiada com uma dose mais elevada de electrões (modo de exposição).
Aqui, apresentamos uma visão geral de como coletar e elétrons processo crio tomografias, usando ATP sintase dímeros na membrana mitocondrial interna como um exemplo. O protocolo a seguir descreve como preparar mitocôndria para crio-ET, como configurare recolha de uma série de inclinação com uma dose total de electrões específico, e como processar a série de inclinação para obter um volume 3D da área de interesse. Uma visão geral do procedimento é ilustrado na figura 1.
O protocolo aqui apresentado fornece uma introdução para crio-ET e subtomogram média das mitocôndrias, mas, essencialmente, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer outro compartimento da célula ou membrana. Para obter os melhores dados possíveis, os passos críticos durante o procedimento são a preparação da amostra, a estratégia de aquisição de processo de congelamento de mergulho e dados. Qualidade da amostra, o que é crítico para o sucesso, depende de um protocolo de congelação otimizado para garantir a espessura do gelo adequado, que é de suma importância para o bom contraste da imagem. A melhor estratégia de aquisição de dados depende do instrumento e amostra. Os parâmetros a serem otimizados incluem doses de elétrons por imagem, sistema de inclinação e desfocar. Adquirir um bom tomografia de uma boa amostra faz tudo ainda mais etapas de processamento mais fácil e garante um resultado final satisfatório.
Cryo-ET combinada com média subtomogram e os ajustes do modelo atômico fornece detalhes de como complexos de proteínas são organizadas em their ambiente celular nativo. A técnica é igualmente adequado para investigar a estrutura de grandes complexos de proteínas de membrana, tais como a cadeia respiratória supercomplexos (1,7 MDA), dímeros ATP sintase (2×500 kDa), ou o complexo do poro nuclear (~ 120 MDa) 8, 9, 17. A organização de ATP dímeros sintase em linhas não pode ser observada por meio de técnicas de alta-resolução, tais como cristalografia de raios-X, RMN ou de uma única partícula de crio-EM, porque as linhas de dímeros são interrompidos por extracção com detergente, o que é um passo necessário para o isolamento e purificação de complexos de proteínas de membrana.
O arranjo da ATP sintase, em fileiras de dímeros de cristas ao longo de arestas é um princípio organizador universal de mitocôndrias em todas as espécies. Os complexos de bombeamento de prótons da cadeia de transporte de elétrons, em particular complexo I (NADH desidrogenase), estão localizados nas áreas de membrana cada lado das linhas 8,9. Esta organização da cadeia respiratória tem profundo impacto na bioenergética mitocondrial. Se as linhas de dímeros não podem formar, devido à ausência de subunidades de proteínas específicas do dímero, as células exibem tempos de vida mais prolongados e reduzida aptidão celular, como observada no mutante de levedura mostradas na Figura 3, 41. Com o crescente interesse em doenças mitocondriais, um detalhada compreensão da base molecular que regula ultra-estrutura e função mitocondrial é de suma importância. Crio-tomografia Electron fornece uma ligação entre a estrutura da proteína foi determinada por meio de métodos de alta resolução, e a distribuição e a disposição dessas proteínas na membrana na escala dos nanómetros. Isso faz com que crio-ET uma ferramenta essencial para a compreensão da estrutura e função mitocondrial na saúde e na doença.
Novos desenvolvimentos e melhorias técnicas em crio-ET incluir estratégias de rotulagem proteína para identificar a posição de protein subunidades em complexos macromoleculares ou a localização das proteínas distintas menores ou menos (<0,5 MDa) em células. Além disso, métodos de processamento EM híbrido, que combinam subtomogram média com a análise de uma única partícula ou reconstrução helicoidal recentemente determinado estruturas de proteínas para ~ 8 a 42, 43. Estes métodos de processamento são atualmente restrita a proteínas purificadas, que são bem separados no gelo ou formam conjuntos helicoidais e não são actualmente aplicáveis a ambientes celulares lotados como mitocôndrias e cristas membranas. Para a coleta de dados, as novas ferramentas de computação e hardware estão sendo desenvolvidas para permitir a aquisição tomografia automatizado, aumentar o contraste da imagem e reduzir a dose total de elétrons necessária. A única limitação fundamental na crio-ET é danos da radiação com a amostra pelo feixe de elétrons. Isso significa que apenas doses muito baixas de elétrons pode ser usado para gravar cada imagem de uma série tomográfica inclinação, resultando em mau sinal-trazão que, em última análise limita a resolução alcançável o-ruído. Os novos detectores de elétrons direta, lançado menos de um ano atrás, estão a revolucionar a área de de uma única partícula de crio-EM 44, 45. Estes novos detectores de proporcionar maior contraste e melhor resolução em doses mais baixas de elétrons. Para elétron crio-tomografia, isso significa que a série de inclinação com tamanhos de etapa menores ou tomografias eixo mesmo duplas podem ser coletadas sem preocupações com danos excessivos de radiação (uma imagem CCD é equivalente em dose de elétrons para 5 imagens detector eletrônica direta). As grandes quantidades de dados produzidos por esses detectores de criar seus próprios desafios em manipulação de dados, processamento e armazenamento, que terão de ser superados.
Além disso, as placas de fase, que trabalham em princípios semelhantes aos usados rotineiramente em microscopia de luz para melhorar o contraste de fase, estão sendo desenvolvidos atualmente para microscopia eletrônica de transmissão 46, 47. Isto deve permitir radiografias para ser recolhido mais perto de se concentrar e, portanto, a maior resolução, enquanto que, ao mesmo tempo preservando as características de baixa resolução necessária para o alinhamento e interpretação dos volumes tomográficos. Tomados em conjunto, esses avanços tecnológicos irá expandir a gama de questões biológicas que podem ser abordados por crio-ET.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Max Planck (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, e WK), o Cluster de Frankfurt "complexos macromoleculares" Excelência financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) e um pós-doutorado EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |