We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.
Electron cryo-tomografie is een krachtig instrument in de structurele biologie, kan visualiseren de driedimensionale structuur van biologische monsters, zoals cellen, organellen, membraan vesicles, of virussen op moleculair detail. Om dit te bereiken, wordt het waterige monster snel verglaasd in vloeibare ethaan, waardoor het in een close-to-native, bevroren-gehydrateerde toestand behoudt. In de elektronenmicroscoop, zijn tilt-serie opgenomen temperatuur van vloeibare stikstof, waaruit 3D tomogrammen worden gereconstrueerd. De signaal-ruisverhouding van het tomografische volume inherent laag. Herkenbare, steeds terugkerende kenmerken worden versterkt door subtomogram middeling, waardoor individuele subvolumes zijn uitgesneden, uitgelijnd en gemiddeld om ruis te verminderen. Zo 3D kaarten met een resolutie van 2 nm of beter worden verkregen. Een vlaag van beschikbare hoge-resolutie structuren om het 3D-volume produceert dan atoommodellen van eiwitcomplexen in hun eigen omgeving. Hier laten we zien hoe we gebruiken elektronen cryo-tomography het in situ organisatie van grote membraaneiwit complexen in mitochondriën. We vinden dat ATP synthase georganiseerd in rijen dimeren langs sterk gebogen toppen van de binnenste membraan cristae, terwijl complex I willekeurig verdeeld in de membraan gebieden aan weerszijden van de rijen. Door subtomogram middeling verkregen we een structuur van het mitochondriale ATP synthase dimeer in de cristae membraan.
Mitochondriën zijn de energie-huizen van de cel. Door het omzetten van een elektrochemische proton gradiënt over het binnenste mitochondriale membraan in chemische binding energie, de mitochondriale ATP synthase produceert het grootste deel van de ATP die cellulaire processen drijft. Om de mechanismen achter mitochondriale energieconversie begrijpen, moeten we de structuur van de ATP synthase in situ te bepalen en om te zien hoe het wordt aangebracht en verdeeld in het binnenste mitochondriale membraan. Hoewel hoge-resolutie structuur van de meeste van de mitochondriale ATP synthase componenten 1-3 en lage resolutie kaarten van het gehele complex 4 beschikbaar zijn, is het belangrijk om de structuur en conformatie van de werkende enzym vast in het membraan. De verdeling van de ATP synthase in het binnenste mitochondriale membraan werd algemeen aangenomen willekeurig zijn, maar een vroege vinden 5 en eigen eerste resultaten 6 aangegeven dat dit niet tHij case. Latere studies van onze onderzoeksgroep en andere 7 hebben bevestigd dat de ATP synthase is aangebracht in lange rijen dimeren langs de strak gekromde randen van de binnenste mitochondriale membraan cristae 8, terwijl de protonpomp van het elektron transport keten lijken zich aan weerszijden van de rijen 9. Deze regeling heeft belangrijke implicaties voor de mechanismen van mitochondriale energie-omzetting.
De techniek die we hebben gebruikt om deze regeling te bepalen is electron cryo-tomografie (cryo-ET). Cryo-ET is momenteel de enige methode die nauwkeurige driedimensionale (3D) volumes van cellen, cellulaire compartimenten of organellen levert bij moleculaire resolutie. Cryo-ET is bijzonder geschikt voor het bestuderen van grote complexen in biologische membranen, omdat de membranen weergegeven met een goed contrast en zijn gemakkelijk terugvinden in 3D tomografie volumes.
Andere methoden om de 3D structuur van cellen of organell studiees niet voorzien moleculair detail. Super-resolutie lichtmicroscopie 10, 11 is super bij het openbaren van de positie of de afstanden tussen lichtgevende labels aan eiwitten van belang met een nauwkeurigheid van enkele tientallen nm, maar het is niet de structuur van het eiwit zelf onthullen, zelfs bij lage resolutie . Transmissie elektronenmicroscopie van seriële secties 12 of block-face beeldvorming door scanning elektronenmicroscopie 13 van kunststof-ingebedde biologische monsters met een lage resolutie uitzicht op cellulaire volumes, maar ook niet de moleculaire details zichtbaar. Atomic force microscopie 14 kan in principe leveren moleculaire of atomaire resolutie, maar alleen op het oppervlak van objecten op atomair vlak, een vaste drager. Tenslotte röntgenstralen 15 of verstrooiing van intense X-ray pulsen van vrije elektronen lasers 16 waarschijnlijk niet de structuur van grote, complexe, aperiodische objecten visualiseren zoals hele cellen of organellen bij molecular resolutie in de nabije toekomst. Dus op dit moment is er geen alternatief voor de cryo-ET voor studies van de 3D-structuur van cellen of organellen op nanometer resolutie.
Cryo-ET is de methode voor het onderzoek van de structuur en conformatie van membraan-geassocieerd eiwit samenstellingen waaronder de nucleaire porie complex 17, het influenzavirus aar complexen 18 en de flagella motor eiwitten 22, 23 maar ook de organisatie van hele bacteriecellen 19 en opneming van pathogene virussen zoals HIV in cellen 20-23. Cryo-ET onschatbare waarde voor het visualiseren filamenteuze eiwitten en hun interacties in de cel, zoals actine filamenten 24 of axonemes 25. De resolutie kan tot 2 nm of beter worden verbeterd door subtomogram gemiddelde 26, waarbij subvolumes van herhaalde, regelmatige trekken zijn gesneden uit een tomografische volume en gemiddeld door enkele deeltjes het proverwerking technieken.
Cryo-ET om de verwerving van een reeks projectie beelden van een specimen dunne (<250 nm) genomen op verschillende hellingshoeken in een transmissie elektronenmicroscoop (TEM). Het monster moet dun zijn, zodat elektronen, die sterk interageren met materie, zijn niet meer dan een keer verspreid. Meervoudige verstrooiing maakt de resulterende beelden moeilijk te interpreteren en vermindert het contrast. Foto's van de geselecteerde monster stippellijn zijn uitgelijnd ten opzichte van elke andere en geprojecteerd in een 3D-ruimte met een geschikt computerprogramma, het genereren van een 3D-volume van het monster. De uitlijning van de beelden wordt bevorderd door goud ijkmarkeringen, die gemengd met het monster voor het invriezen. Idealiter 10 of meer gelijkmatig verdeeld ijkmarkeringen aanwezig moeten zijn in elke afbeelding om een goede afstemming te bereiken.
Om moleculaire detail te observeren, monsters zijn duik-ingevroren in vloeibare ethaan, die hun geboorteland gehydrateerde toestand behoudt. Invriezen in vloeibaarethaan is zo snel (~ 10 5 ° C / sec) 27 dat water niet kristalliseren, maar blijft in een verglaasd, glas-achtige toestand. Ijskristal vorming schade gevoelige biologische structuren. Al biologische monsters lijden stralingsschade er een limiet aan het totaal aantal verstrooiingsgebeurtenissen het monster kan verdragen. Afbeeldingen worden dan overgenomen in een lage dosis mode: Een gebied van de rente wordt vastgesteld bij een lage vergroting (1,500X) met een elektron dosis onder de 1 e – / nm 2 (zoekmodus). Het beeld wordt dan gericht op een grotere vergroting van het gebied van belang (scherpstelling). Alleen wanneer een beeld wordt verkregen, is het gebied van belang bestraald met een hogere dosis elektronen (belichting).
Hier presenteren we een overzicht van hoe het verzamelen en verwerken elektronen cryo-tomogrammen, met behulp van ATP synthase dimeren in het binnenste mitochondriale membraan als een voorbeeld. Het volgende protocol beschrijft hoe mitochondriën voor cryo-ET voor te bereiden, het opzetten vanen laat een tilt serie met een specifieke totale elektronen dosis en hoe de tilt serie een 3D volume van het gebied van belang te verkrijgen verwerken. Een overzicht van de procedure is weergegeven in figuur 1.
De hier gepresenteerde protocol geeft een introductie cryo-ET en subtomogram middeling van mitochondria, maar in wezen dezelfde procedure kan worden toegepast op andere cel compartiment of membraan. Om de best mogelijke gegevens te verkrijgen, kritische stappen in de procedure zijn monstervoorbereiding, de sprong te wagen invriezen en data-acquisitie strategie. Sample kwaliteit, wat essentieel is voor succes, afhankelijk van een geoptimaliseerde invriesprotocol geschikte ijsdikte, dat van het grootste belang voor een goede beeldcontrast waarborgen. De optimale data-acquisitie strategie hangt af van het instrument en monster. Parameters optimaliseren omvat elektron dosis per beeld, tilt regeling en defocus. Het verwerven van een goede tomogram van een goede steekproef maakt alle verdere verwerking stappen makkelijker en zorgt voor een bevredigend eindresultaat.
Cryo-ET gecombineerd met subtomogram middeling en atoommodel montage geeft details over hoe eiwitcomplexen zijn gerangschikt in thEIR inheemse cellulaire omgeving. De techniek is geschikt voor het onderzoeken van de structuur van grote membraaneiwit complexen, zoals de ademhalingsketen supercomplexen (1,7 MDa), ATP synthase dimeren (2×500 kDa) of de nucleaire porie complex (~ 120 MDa) 8, 9, 17. De organisatie van ATP synthase dimeren in rijen kunnen niet worden waargenomen door hoge-resolutie technieken zoals röntgenkristallografie, NMR of single-deeltjes cryo-EM, omdat het dimeer rijen verstoord detergentextractie, hetgeen een noodzakelijke stap in het isoleren en zuivering van membraaneiwit complexen.
De opstelling van de ATP synthase in rijen langs dimeren cristae richels is een universeel organiserend beginsel van mitochondria in alle soorten. De proton-pompen complexen van de elektronentransport keten, met name complex I (NADH dehydrogenase), zijn in het membraan gebied weerszijden van de rijen 8,9. Deze organisatie van de respiratoire keten heeft grote invloed op de mitochondriale bio-energetica. Als het dimeer rijen niet kan vormen door de afwezigheid van dimeer-specifiek eiwit subeenheden, de cellen vertonen langere generatietijden en verminderde cellulaire film, zoals waargenomen in de gist mutant figuur 3 41. Met de groeiende belangstelling in mitochondriale ziekten, een gedetailleerde begrip van de moleculaire basis voor mitochondriale ultrastructuur en de functie is van het grootste belang. Electron cryo-tomografie een koppeling tussen eiwitstructuur bepaald met hoge-resolutie methoden, en de verdeling en plaatsing van deze eiwitten in het membraan op de schaal van nanometers. Dit maakt cryo-ET een essentieel instrument voor het begrijpen van mitochondriale structuur en functie in gezondheid en ziekte.
Verdere technische ontwikkelingen en verbeteringen in de cryo-ET bevatten eiwit-labeling strategieën om de positie van Protei identificerenn subeenheden in macromoleculaire complexen of de plaats van kleinere of minder duidelijk eiwitten (<0,5 MDa) in cellen. Bovendien hebben hybride EM verwerkingsmethoden die subtomogram gemiddelde combineren deeltje analyse of schroefvormige reconstructie recent vastgestelde eiwitstructuren naar ~ 8 A 42, 43. Deze verwerkingsmethoden zijn momenteel beperkt tot gezuiverde eiwitten, die goed gescheiden zijn in ijs of vormen spiraalvormige assemblages en zijn niet van toepassing op drukke cellulaire omgevingen zoals mitochondriën en cristae membranen. Voor het verzamelen van gegevens, zijn nieuwe computer-en hardware-instrumenten worden ontwikkeld om geautomatiseerde tomogram overname mogelijk te maken, verhogen het contrast en de totale benodigde elektronen dosis te verminderen. De enige fundamentele beperking in cryo-ET is stralingsschade aan het monster door de elektronenbundel. Dit betekent dat slechts zeer lage elektron doses kunnen worden gebruikt om de afbeelding van een tomografische tilt serie opnemen, wat resulteert in slechte signaal-to-ruisverhouding die uiteindelijk beperkt de haalbare resolutie. De nieuwe directe elektron detectoren, minder dan een jaar geleden uitgebracht, zijn op dit moment een revolutie op het gebied van single-deeltje cryo-EM 44, 45. Deze nieuwe detectoren bieden een hogere contrast en betere resolutie bij lagere doses elektronen. Voor elektronen cryo-tomografie, betekent dit dat tilt serie met kleinere stapgrootte of tweeassige tomogram kan worden verzameld zonder zorgen over de hoge stralingsschade (een CCD gelijk in electron dosis 5 rechtstreekse beelden elektron detector). De enorme hoeveelheden gegevens die door deze detectoren creëren hun eigen uitdagingen in data handling, bewerking en opslag, die moeten worden overwonnen.
Bovendien faseplaten die werken soortgelijke principes als die routinematig gebruikt in lichtmicroscopie om fasecontrast verbeteren, zijn in ontwikkeling voor transmissie elektronenmicroscopie 46, 47. Dit moet tomogrammen dichter verzamelen richten en derhalve een hogere resolutie, terwijl tegelijkertijd behouden lage resolutie nodig uitgelijnd zijn en interpretatie van tomografische volumes heeft. Tezamen zullen deze technologische vooruitgang sterk uitbreiden van het bereik van de biologische vragen die door cryo-ET kan worden aangepakt.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Max-Planck-Gesellschaft (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, en WK), de Cluster of Excellence Frankfurt "macromoleculaire complexen" gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) en een postdoctoraal EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |