私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。
クライオ電子断層撮影は、このような分子細部の細胞、細胞小器官、膜小胞、またはウイルスなどの生体試料の三次元構造を可視化することが可能な構造生物学における強力なツールです。これを達成するために、水性サンプルが急速に近いからネイティブ、凍結水和状態に保存し、液体エタン中にガラス化される。電子顕微鏡では、傾斜シリーズは、3次元断層像を再構成され、そこから液体窒素温度で記録される。断層ボリュームの信号対雑音比は、本質的に低い。認識可能な、定期的な機能には、個別のサブボリュームは、切り出さ整列し、ノイズを低減するために平均化されることでsubtomogram平均、によって強化されています。このように、2波長以上の解像度を持つ3Dマップを得ることができる。 3Dボリュームに利用可能な高解像度構造のフィットは、その後、それらの天然環境におけるタンパク質複合体の原子モデルを生成する。ここで私たちは、電子クライオtomograpを使用する方法を示してHYは、ミトコンドリアの大きな膜タンパク質複合体のin situで組織を研究する。私たちは、複雑な私はランダムに行のいずれかの側にメンブレン領域に分布しているのに対し、ATP合成酵素は、内膜クリステの高度に湾曲した頂部に沿って二量体の列に編成されていることがわかります。 subtomogram平均することにより、私たちはクリステ膜内ミトコンドリアATP合成酵素二量体の構造を得た。
ミトコンドリアは、細胞のパワー·ハウスである。化学結合エネルギーにミトコンドリア内膜を横切る電気化学的プロトン勾配を変換することにより、ミトコンドリアATP合成酵素は、細胞プロセスを駆動するATPの大部分を生成する。ミトコンドリアのエネルギー変換の背後にあるメカニズムを理解するためには、in situでの ATP合成酵素の構造を決定するために、それが配置され、ミトコンドリア内膜に分布しているかを知る必要がある。全体錯体4のミトコンドリアATPシンターゼのコンポーネント1-3と低解像度のマップのほとんどの高分解能構造が利用可能であるが、それは、膜に加工酵素の構造およびコンフォメーションを確立することが重要である。ミトコンドリア内膜でのATP合成酵素の分布は広く、ランダムであると仮定されているが、5を見つけ早期に私たち自身の最初の結果図6は、これがtではないことが示された彼の場合。電子伝達鎖のプロトンポンプがいずれかの側に位置するように見える一方、当社グループとその他の7からの後続の研究は、ATP合成酵素が、ミトコンドリア内膜のクリステ8のきつく湾曲した隆起部に沿って二量体の長い列に配置されていることを確認した行9の。この配置は、ミトコンドリアのエネルギー変換のメカニズムの重要な意味を持つ。
私たちはこの配置を決定するために使用した手法は、電子クライオトモグラフィー(クライオ-ET)である。クライオ-ETは、現在、分子分解能で細胞、細胞区画または小器官の正確な3次元(3D)ボリュームを提供する唯一の方法です。膜は、良好なコントラストで表示され、3次元断層体積でトレースが容易であるためクライオ-ETは、生体膜に大きな複合体を研究するために特に適している。
細胞またはorganellの三次元構造を研究するための他の方法ESは、分子の詳細を提供しない。超解像光学顕微鏡10、図11は、数十nmの精度で目的のタンパク質に付着した発光ラベル間の位置や距離を明らかに優れているが、それは、低解像度で、タンパク質自体の構造を明らかにしない。プラスチック包埋された生物学的サンプルの電子顕微鏡13を走査して、連続切片12またはブロック顔画像の透過型電子顕微鏡は、細胞容積の低解像度のビューを提供するが、同様の分子の詳細を明らかにしない。原子間力顕微鏡14は、原理的には 、分子あるいは原子分解能を提供するが、唯一の原子レベルで平坦な、固体支持体上の物体の表面にすることができる。最後に、X線断層撮影法15または自由電子レーザーからの強いX線パルスの散乱16は、mにおける全細胞または細胞小器官などの、大規模で複雑 な、非周期的なオブジェクトの構造を明らかにしにくい予見可能な将来にolecular解像度。したがって、現時点で、ナノメートル分解能での細胞または細胞小器官の3D構造の研究のために、ETをクライオする代替はありません。
クライオ-ETは、核膜孔複合体17を含む膜結合タンパク質集合体の構造とコンフォメーションを調べるために選択される方法である、インフルエンザスパイクは18と錯体を形成すると、鞭毛モータータンパク質22、23だけでなく、細菌細胞全体19の組織化細胞20-23にログインHIV等の病原性ウイルスの侵入。クライオ-ETは、アクチンフィラメント24または軸糸25を含む繊維状タンパク質や細胞内のそれらの相互作用を、可視化するための非常に貴重です。解像度が繰り返される、規則的な特徴のサブボリュームは、単一粒子画像プロ断層ボリュームから切り出し、平均化されることによりsubtomogramは、26を平均化することにより2nm程度以上に向上させることができるcessing技術。
クライオ-ETは、透過型電子顕微鏡(TEM)で異なる傾斜角度で撮影された薄い試料(<250nmで)の投影画像の系列を取得することを含む。物質と強く相互作用する電子は、一度以下で散乱されないように、試料が薄くなければならない。多重散乱は解釈が得られる画像を困難にし、コントラストを低下させる。選択された標本領域の画像がそれぞれ互いに対して位置合わせされ、検体の3次元ボリュームを生成する、適切なコンピュータプログラムによって、3D空間に投射される。画像の位置合わせは、冷凍前にサンプルと混合された金基準マーカによって補助される。理想的には10又はより均一に分布基準マーカは、良好なアラインメントを達成するために、各画像に存在すべきである。
分子細部を観察するために、試料はプランジ凍結液体エタン中で、それらの天然の水和状態を維持している。液体中にフリーズエタンは、水が結晶化しないことを(〜10 5℃/秒)27非常に高速ですが、ガラス化し、ガラスのような状態のままになります。氷晶形成損傷敏感生物学的構造。生物学的サンプルは、放射線損傷に苦しむように、試料が耐えられる散乱事象の合計数には限界がある。画像は、このように低線量モードで取得されています。関心領域は、1電子以下の電子線量を低倍率(1,500X)で識別されている– / nm 2で(サーチモード)。画像は、関心(フォーカスモード)の面積から、高倍率で結像される。画像が取得された場合にのみ、関心領域は、より高い電子線量(撮影モード)を照射する。
ここでは、例として、ミトコンドリア内膜でのATP合成酵素二量体を使用して、クライオ電子断層像を収集し、処理する方法の概要を提示する。以下のプロトコルを設定する方法を、クライオ-ETのためにミトコンドリアを準備する方法について説明します特定の総電子線量で傾斜シリーズを収集し、どのように関心領域の3Dボリュームを得るために、傾斜シリーズを処理する。手順の概要は図1に示されている。
ここで紹介するプロトコルは、ミトコンドリアのsubtomogram平均-ETをクライオために紹介していますが、本質的に同じ手順が、他の細胞区画又は膜に適用することができます。可能な限り最良のデータを取得するには、手順の間の重要なステップは、サンプル調製、プランジ凍結プロセスとデータ·アクイジション戦略である。成功のために重要であるサンプルの品質は、良好な画像コントラストのために最も重要である適切な氷の厚さを確保するために最適化された凍結プロトコールに依存する。最適なデータ買収戦略は、機器およびサンプルに依存します。最適化すべきパラメータは、画像ごとに電子線量、チルト方式やデフォーカスなどがあります。良いサンプルの良い断層画像を取得すると、すべてのさらなる処理工程が容易になり、良好な最終結果を保証します。
クライオ-ETは、タンパク質複合体が目に配置されている方法の詳細を提供subtomogram平均と原子モデルフィッティングと組み合わせEIRネイティブ細胞環境。技術は、呼吸鎖supercomplexes(1.7値、MDa)、ATP合成酵素の二量体(2×500 kDa)の、または核膜孔複合体(〜120値、MDa)8、9、17のような大規模な膜タンパク質複合体の構造を調査するために等しく適しています。ダイマー行が分離に必要な工程である界面活性剤抽出によって破壊されるため、行にATPシンターゼ二量体の組織は、このようなX線結晶学、NMR又は単一粒子低温電子顕微鏡などの高解像度化技術によって観察することができないおよび膜タンパク質複合体の精製。
クリステの尾根に沿って二量体の行のATP合成酵素の配列は、すべての種におけるミトコンドリアの普遍的な組織原則である。特に、複合体中の電子伝達鎖のプロトンポンプ複合体I(NADHデヒドロゲナーゼ)は、膜面積行8のいずれかの側に配置されている9。呼吸鎖のこの組織は、ミトコンドリアの生体エネルギーに大きな影響を持っています。ダイマー列による二量体特異的タンパク質サブユニットの不在に形成することができない場合、セルは図3の 41に示されている酵母変異株で観察されるように、より長い世代時間を示し、細胞の適応度を減少させた。ミトコンドリア病への関心の高まりにより、詳細なミトコンドリアの超微細構造と機能を支配する分子基盤を理解することが最も重要である。クライオ電子断層撮影法は、タンパク質の高分解能の方法によって決定された構造、およびナノメートルのスケールでの膜におけるこれらのタンパク質の分布や配置の間のリンクを提供する。これはクライオ-ETの健康と病気にミトコンドリアの構造と機能を理解するために不可欠なツールになります。
クライオ-ETにおける更なる技術開発や改良がproteiの位置を特定するために、タンパク質標識戦略を含める高分子複合体中のnサブユニットまたは細胞内のより小さい以下の異なるタンパク質の位置(<0.5 MDA)があります。さらに、単一粒子分析又はヘリカル再構成で平均化subtomogramを組み合わせるハイブリッドEM処理方法は、最近〜8オングストローム42,43にタンパク質の構造を決定した。これらの処理方法は、現在だけでなく氷で分離又はヘリカルアセンブリを形成しており、現在、ミトコンドリアとクリステ膜のような混雑した細胞環境には適用されませんされて精製されたタンパク質に制限されています。データ収集のために、新たなコンピューティングおよびハードウェアツールは、自動化された断層像の取得を可能にする画像のコントラストを向上させ、総所要の電子線量を低減するために開発されている。クライオ-ETにおける唯一の根本的な制限は、電子ビームによる試料への放射線障害である。これは、非常に低い電子線量が悪い信号対tの結果として、断層の傾斜系列の各画像を記録するために使用することができることを意味最終的に達成可能な分解能を制限オルト雑音比。一年前よりも低いリリースされた新しい直接電子検出器は、現在、単一粒子低温電子顕微鏡44、45の分野に革命をもたらしている。これらの新しい検出器は、高コントラストと低電子投与量で良好な分解能を提供します。クライオ電子断層撮影の場合、これは過度の放射線損傷(1つのCCDイメージは5直接電子検出器画像に電子線量で同等である)についての懸念なしに収集することができるより小さなステップサイズあるいは二軸断層像とその傾斜シリーズを意味する。これらの検出器によって生成される膨大な量のデータが克服されなければならないデータの取り扱い、処理および記憶で自分の課題を作成します。
また、位相コントラストを高めるために光学顕微鏡で日常的に使用されるものと同様の原理で動作する位相差板は、現在、透過型電子顕微鏡46、4のために開発されている7。これは同時にアライメント断層ボリュームの解釈のために必要な低解像度の特徴を維持しながら断層像は、高解像度で、したがって焦点を合わせにより近い収集することを可能にするべきである。まとめると、これらの技術の進歩は非常にクライオ-ETによって対処することができる生物学的な質問の範囲を拡大していきます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、マックス·プランク協会(KMD、BD、AWM、結核、TBB、DJM、およびWK)、ドイツ学術振興(WK)とポスドクEMBO長期の資金優秀フランクフルト「巨大分子複合体」のクラスタによってサポートされていましたフェローシップ(VAMG)。
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |