אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.
cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא כלי רב עוצמה בביולוגיה מבנית, מסוגל לדמיין את המבנה התל ממדי של דגימות ביולוגיות, כגון תאים, האברונים, שלפוחית קרום, או וירוסים בפירוט מולקולרי. כדי להשיג זאת, המדגם המימית הוא מזוגג במהירות באתאן הנוזלי, השומר אותו ב, מדינה קפוא התייבשות קרובה לילידים. במיקרוסקופ האלקטרונים, סדרת הטיה נרשמת בטמפרטורה של חנקן נוזלי, שממנו tomograms 3D משוחזר. יחס אות לרעש של טומוגרפיה הנפח הוא מטבעו נמוך. תכונות מוכרות, חוזרות משופרות באמצעות מיצוע subtomogram, שבו subvolumes בודד לגזור, מיושר וממוצע כדי להפחית את הרעש. בדרך זו, 3D מפות עם רזולוציה של 2 ננומטר או טוב יותר ניתן להשיג. התאמה של מבנים ברזולוציה גבוהה הזמינים ל3D הנפח ואז מייצרת מודלים אטומיים של קומפלקסי חלבונים בסביבה הטבעית שלהם. כאן אנו מראים כיצד אנו משתמשים cryo-tomograp אלקטרוןHY ללמוד הארגון באתרו של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים במיטוכונדריה. אנו מוצאים כי synthases ATP מאורגנים בשורות של הדימרים לאורך קודקודיו מעוגלים מאוד של cristae הקרום הפנימי, ואילו אני מורכב מופץ באופן אקראי באזורי הקרום משני צדי השורות. על ידי מיצוע subtomogram השגנו מבנה של דימר synthase ATP במיטוכונדריה בתוך קרום cristae.
המיטוכונדריה הוא הכח, בתים של התא. על ידי המרת שיפוע פרוטון אלקטרוכימי על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי לתוך קשר כימי באנרגיה, synthase ATP במיטוכונדריה מייצר את רוב ATP שמניע את תהליכים תאיים. על מנת להבין את המנגנונים שמאחורי המרת אנרגיה של המיטוכונדריה, אנחנו צריכים לקבוע את המבנה של synthase ATP באתר, ולגלות איך זה מסודר והופץ בקרום המיטוכונדריה הפנימי. למרות שמבנים ברזולוציה גבוהה של רוב המרכיבים של המיטוכונדריה ATP synthase 1-3 והמפות ברזולוציה הנמוכה של 4 המורכבים כולו זמינים, חשוב להקים את המבנה וקונפורמציה של האנזים הפועל בקרום. חלוקת synthase ATP בקרום המיטוכונדריה הפנימית כבר הניחה באופן נרחב כדי להיות אקראי, אבל מוקדם מציאת 5 והתוצאות הראשוניות שלנו 6 הצביעו על כך שזה לא tהוא המקרה. מחקרים מאוחרים יותר מהקבוצה שלנו ואחרים 7 אישרו כי synthase ATP מסודר בשורות של הדימרים לאורך הרכסים בחוזקה המעוגלים של cristae קרום המיטוכונדריה הפנימי 8 ארוכות, ואילו משאבות הפרוטון של שרשרת העברת אלקטרונים מופיעות להיות ממוקמות בכל צד של השורות 9. יש הסדר זה השלכות חשובות על המנגנונים של המרת אנרגיה של המיטוכונדריה.
הטכניקה ששמשנו לקביעת הסדר זה היא cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (cryo-ET). Cryo-ET הוא כיום השיטה היחידה המספקת כמויות מדויקות תלת ממדים (3D) של תאים, תאים סלולריים או אברונים ברזולוציה מולקולרית. Cryo-ET הוא מתאים במיוחד ללימוד מתחמים גדולים בממברנות ביולוגיות, משום שהקרומים מופיעים עם ניגודיות טובה וקלים לאתר בכרכי טומוגרפיה 3D.
שיטות אחרות כדי ללמוד את מבנה 3D של תאים או organelles לא מספק פירוט מולקולרי. הרזולוציה סופר מיקרוסקופ אור 10, 11 היא מעולה בחושף את העמדה או מרחקים בין תוויות פולטות אור מחוברות לחלבוני עניין עם דיוק של עשרות ננומטר, אבל זה לא לחשוף את המבנה של החלבון עצמו, אפילו ברזולוציה נמוכה . במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סעיפים סידוריים 12 או לחסום פנים הדמיה על ידי סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים 13 של דגימות ביולוגיות מוטבע פלסטיק לספק תצוגות ברזולוציה נמוכה של כרכים סלולריים אבל גם לא חושף פרטים מולקולריים. כוח מיקרוסקופיה האטומית 14 יכולה בעיקרון לספק רזולוציה מולקולרית או אפילו אטומית, אבל רק על פני השטח של אובייקטים על תמיכה אטומית שטוחה, מוצקה. לבסוף, טומוגרפיה רנטגן 15 או פיזור של פולסים חזקים של קרינת X מלייזרי אלקטרונים חופשיים היא 16 סבירה כדי לחשוף את המבנה של אובייקטים גדולים ומורכבים, לא מחזוריים כגון תאים או אברונים שלמים במ 'הרזולוציה olecular בעתיד הנראה לעין. כך בהווה, אין חלופה לקריו ET ללימודים של מבנה 3D של תאים או אברונים ברזולוציה ננומטר.
Cryo-ET הוא שיטת הבחירה לבחינת המבנה והמבנה של מכלולים הקשורים חלבון קרום כוללים המתחם הגרעיני הנקבובית 17, ספייק שפעת קומפלקסי 18, ושוטונים חלבוני מנוע 22, 23 אלא גם הארגון של תאים שלמים של חיידקי 19 וכניסה של וירוסים פתוגניים כגון HIV בתאי 20-23. Cryo-ET הוא לא יסולא בפז המאפשר הדמיה חלבונים סיביים ויחסי הגומלין שלהם בתא, כולל סיביים אקטין 24 או axonemes 25. הרזולוציה ניתן לשפר עד 2 ננומטר או טוב יותר על ידי subtomogram ממוצע 26, לפיה subvolumes של תכונות חוזרות ונשנות, רגילות נחתכות מטומוגרפיה נפח ובממוצע על ידי פרו תמונת חלקיק יחידטכניקות cessing.
Cryo-ET כרוך ברכישה של סדרה של תמונות הקרנה של דגימה דקה (<250nm) נלקחה בזוויות הטיה שונות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). הדגימה חייבת להיות רזה כדי שאלקטרונים, אשר אינטראקציה חזקה עם עניין, פזורים לא יותר מפעם אחת. פיזור מרובה הופך את התמונות וכתוצאה מכך קשה לפרש, ומפחית את הניגוד. תמונות של אזור הדגימה שנבחר מיושרות ביחס לכל אחד אחר ומוקרנות לתוך חלל 3D על ידי תוכנת מחשב מתאימה, יצירת נפח 3D של הדגימה. היישור של התמונות נעזר בסמני fiducial זהב, אשר מעורבבים עם המדגם לפני ההקפאה. סמני fiducial באופן אידיאלי 10 או יותר באופן שווה מופצים צריכים להיות נוכחים בכל תמונה כדי להשיג התאמה טובה.
כדי לצפות בפירוט מולקולרי, דוגמאות הן לצלול קפוא באתאן הנוזלי, השומר על מדינת התייבשות האם שלהם. הקפאה בנוזלאתאן הוא כל כך מהר (~ 10 5 ° C / sec) 27 שהמים אינו להתגבש אבל נשאר במדינה מזוגגת, כמו זכוכית. גביש קרח נזקי היווצרות מבנים ביולוגיים רגישים. כדגימות ביולוגיות סובלות מנזקי קרינה, יש גבול למספר הכולל של אירועי פיזור הדגימה יכולה לסבול. תמונות ובכך רכשו במצב במינון נמוך: שטח של עניין מזוהה בהגדלה נמוכה (1,500X) עם מינון אלקטרון להלן דואר 1 – / (מצב חיפוש) ננומטר 2. התמונה לאחר מכן התמקדה בהגדלה גבוהה יותר, את האזור של עניין (מצב מיקוד). רק כאשר תמונה שנרכשה, את תחומי עניין שלו מוקרנים עם מינון גבוה יותר אלקטרונים (מצב חשיפה).
כאן, אנו מציגים סקירה של איך לאסוף וcryo-tomograms אלקטרון תהליך, באמצעות הדימרים synthase ATP בקרום המיטוכונדריה הפנימי לדוגמא ירושלים. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין מיטוכונדריה לcryo-ET, כיצד להגדיר אתולאסוף סדרת הטיה עם מנה ספציפית כוללת אלקטרון, וכיצד לעבד את הסדרה להטות להשיג 3D נפח של השטח של עניין. סקירה של ההליך מתואר באיור 1.
הפרוטוקול המובא כאן מספק מבוא לקריו ET ומיצוע subtomogram של מיטוכונדריה, אבל בעצם אותו ההליך יכול להיות מיושם על כל תא תא אחר או קרום. כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים, שלבים קריטיים במהלך ההליך הם הכנת מדגם, אסטרטגיית רכישת תהליך ההקפאה לצלול ונתונים. איכות מדגם, שהוא קריטי להצלחה, תלויה בפרוטוקול הקפאה מותאמת על מנת להבטיח עובי קרח מתאים, אשר הוא בעלת חשיבות עליונה לניגוד תמונה טוב. אסטרטגיית הרכישות של נתונים אופטימליות תלויה במכשיר והמדגם. פרמטרים להיות מותאמים כוללים מנת אלקטרון לכל תמונה, תכנית ההטיה וdefocus. רכישת tomogram טובה של מדגם טוב עושה את כל העיבוד נוסף על שלבים יותר קל ומבטיח תוצאה סופי משביעת רצון.
שילוב Cryo-ET עם מיצוע subtomogram והמתאים מודל אטומי מספק פרטים של איך קומפלקסי חלבונים מסודרים בהסביבה סלולרית ילידי Eir. הטכניקה היא מתאים באותה מידה לחקירת המבנה של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים, כגון supercomplexes נשימה שרשרת (1.7 מד"א), הדימרים synthase ATP (2×500 KDA), או מורכבת הנקבובית הגרעיני (~ 120 מד"א) 8, 9, 17. הארגון של הדימרים synthase ATP לשורות לא יכול להיות שנצפה על ידי טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, NMR או חלקיק יחיד cryo-EM, כי שורות דימר הם שיבשו על ידי מיצוי חומר ניקוי, שבו הוא צעד הכרחי בבידוד וטיהור של קומפלקסי חלבוני קרום.
ההסדר של synthase ATP בשורות של הדימרים לאורך רכסי cristae הוא עיקרון מארגן אוניברסלי של המיטוכונדריה בכל המינים. מתחמי פרוטון שאיבה של שרשרת העברת אלקטרונים, במתחם מסוים אני (dehydrogenase NADH), ממוקמים באזורי הקרום משני צדי השורות 8,9. ארגון זה של שרשרת הנשימה יש השפעה עמוקה על bioenergetics המיטוכונדריה. אם שורות דימר לא יכולות להיווצר בשל העדר של יחידות משנה חלבון דימר ספציפי, תאי תערוכת פעמים דור ארוכים יותר וכושר סלולארי מופחת, כפי שנצפו במוטצית השמרים שמוצגת באיור 3 41. עם העניין ההולך וגובר במחלות מיטוכונדריאליות, מפורטים הבנה של הבסיס המולקולרי השולט ultrastructure ותפקוד המיטוכונדריה היא בעלת חשיבות עליונה. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון מספקת קישור בין מבנה חלבון נקבע על פי שיטות ברזולוציה גבוהה, וההפצה וסידור של חלבונים אלה בקרום בקנה המידה של ננומטר. זה עושה cryo-ET כלי חיוני להבנת מבנה ותפקוד של המיטוכונדריה בבריאות ובחוליים.
התפתחויות נוספות טכניות ושיפורים בcryo-ET כוללים אסטרטגיות חלבון תיוג לזהות את עמדתו של protein תת יחידות במתחמי macromolecular או המיקום של חלבונים שונים קטנים יותר או פחות (<0.5 מד"א) בתאים. בנוסף, שיטות עיבוד EM ההיברידי, המשלבות מיצוע subtomogram עם ניתוח חלקיקים בודד או שחזור סליל לאחרונה נקבעו מבנים חלבוניים ל~ 8 42 A, 43. שיטות עיבוד אלו כרגע מוגבלות לחלבונים מטוהרים, אשר מופרדים היטב בקרח או ליצור מכלולי סליל וכרגע אינו ישימים לסביבות סלולריות צפופות כמו המיטוכונדריה וcristae ממברנות. לאיסוף נתונים, כלים מחשוב וחומרה חדשים מפותחים על מנת לאפשר רכישת tomogram אוטומטית, להגדיל את ניגוד תמונה ולהפחית את סך מינון אלקטרון הנדרש. המגבלה הבסיסית בלבד בcryo-ET היא נזקי קרינה למדגם על ידי קרן האלקטרונים. משמעות דבר היא כי מינוני אלקטרון רק נמוכים מאוד יכולים לשמש כדי להקליט כל תמונה של סדרת ההטיה טומוגרפיה, וכתוצאה מכך אות t העניo-רעש יחס שסופו של דבר מגביל את הרזולוציה השגה. הגלאים החדשים האלקטרון ישיר, שוחררו לפני פחות משנה, בימים אלו מהפכה בתחום חלקיק היחיד cryo-EM 44, 45. גלאים החדשים אלה מספקים ניגודיות גבוהה יותר ורזולוציה טובה יותר במינונים נמוכים יותר אלקטרונים. לcryo-טומוגרפיה של אלקטרון, זה אומר שסדרת הטיה עם גדלי צעד קטנים או tomograms ציר אפילו כפול ניתן לאסוף חששות לגבי נזקי קרינה מוגזמים (CCD תמונה אחת שווה במינון אלקטרון עד 5 תמונות גלאי אלקטרונים ישירות) בלי. הכמויות גדולות של נתונים היוצר על ידי גלאים אלה יוצרים אתגרים משלהם בנתונים טיפול, עיבוד ואחסון, אשר יש להתגבר.
בנוסף, צלחות שלב, הפועלות על עקרונות דומים לאלה המשמשים באופן שיגרתי במיקרוסקופ אור כדי לשפר את ניגוד שלב, בימים אלו שפותחו עבור מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 46, 47. צריך זה לאפשר tomograms שייגבה קרוב יותר להתמקד, ולכן ברזולוציה גבוהה יותר, ואילו באותו הזמן השמירה ברזולוציה נמוכה תכונות הכרחיות ליישור ופרשנות של כרכים טומוגרפית. יחדיו, התקדמות הטכנולוגית אלה תרחיב באופן משמעותי את מגוון שאלות ביולוגיות שניתן לטפל על ידי cryo-ET.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק (KMD, BD, AWM, שחפת, TBB, DJM, וWK), האשכול של אקסלנס "מכלולי Macromolecular" פרנקפורט ממומן על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) וטווח ארוך EMBO הבתר מלגה (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |