Kapsül şişme deneyi Reaksiyon Streptococcus pneumoniae serotip için altın standart bir tekniktir. Bu teknik mikroskop ve belirli pnömokok antiseranın kullanır ve yaygın dünya çapında bir referans ve araştırma laboratuvarlarında kullanılır.
Streptococcus pneumoniae kapsül 90 farklı serotip (pnömokok) vardır. Yanı sıra pnömokok epidemiyolojisi anlamak için bir araçtır olarak, kapsül serotipleme aşı etkinliği ve darbe çalışmaları için yararlı bilgiler sağlayabilir. Kapsül şişme deneyi Reaksiyon pnömokok kapsüler serotiplemeye altın standart yöntemdir. Bir yöntem olup, kapsüler polisakarite karşı havuzlanmış ve spesifik antiserumlarla bir pnömokok kökenli hücre süspansiyonu test içerir. Antijen-antikor reaksiyonları mikroskopik olarak gözlenir. Bir bakteri hücre süspansiyonu 1) hazırlanması, bir cam slayt üzerinde hücrelerin ve antiserumlar 2) karıştırma, ve 3) bir mikroskop kullanılarak kapsül şişme deneyi tepki okuma: Protokol üç ana adım vardır. Reaksiyon, kapsül şişme deneyi gerçekleştirmek için oldukça basit ve uygun bir mikroskop ve antisera mevcuttur yerde uygulanabilir.
Streptococcus pneumoniae (pnömokok) hastalık yükü kaynak yoksul ülkelerde 1 ağırlıklı olarak düşen, yılda beş yaşın altında yaklaşık 800.000 çocuk ölümünden sorumlu. Pnömokok hastalıkları örneğin sepsis, menenjit ve zatürre 2 gibi ciddi hayatı tehdit eden enfeksiyonlar, akut otitis media gibi lokalize enfeksiyonlar şiddeti değişir. Pnömokok 90 üzerinde kapsüler serotip 3, 4, tarif edilmiştir. Mevcut pnömokok aşıları invasif hastalık 5, 6 çoğunluğu için sorumlu olan serotip karşı koruma sağlar. Bununla birlikte, aşıların yaygın kullanımı, nazofarenks taşıyıcı ve invasif hastalık 7, 8, hem nonvaccine serotiplerinin aşıda bulunan serotiplerin değiştirilmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu epidemiyolojik için serotipleme önemini vurgulamaktadırgözetim ve uzun vadeli aşı etkisi 9 inceler.
Pnömokok tiplemesi için altın standart yöntem, 1902 yılında ilk Neufeld tarafından açıklanan kapsül şişme deneyi reaksiyonu olarak bilinen kapsül reaksiyon testi, (Avusturya 10 bakınız). Uyum yüksek derecede laboratuarlar arasında ve kapsül şişme deneyi reaksiyon ve diğer serotipleme yöntemler 11-13 arasında bulunmuştur. Kapsül şişme deneyi reaksiyonu 10, 14-16 çeşitli varyasyonları vardır. Burada tarif edilen metot, bir karşı leke veya yağ daldırma objektif kullanımını gerektirmeyen, daha ziyade, hazırlanan numune bir damla yazarak serumu ile karıştırılır ve 400X büyütme altında hemen incelenmiştir.
Reaksiyon genellikle kapsül şişme deneyi ticari olarak temin edilebilen anti-serumlar kullanılarak gerçekleştirilir. Burada tarif edilen yöntem, daha düşük maliyetli yapmak, bazı başka yöntemler 16, 17 oranla daha az anti-serumlar kullanır. Bir kez isolate bir pozitif reaksiyon gözlenmiştir kadar sekans antisera havuzları ile test edilir, bir pnömokok olarak tanımlanır. Her havuz antiserum 91 pnömokok serotipleri 18 karşı oluşturulan antiserumların farklı karışımları içerir. Havuz kurulduktan sonra, reaktif havuzda içerdiği bireysel tip antisera ve grup sırayla ayrı ayrı test edilmiştir. Grubu antisera (örneğin, Grup 22 antiserum serotip 22F ve 22A ile reaksiyona girer), belirli bir grup içindeki tüm serotipler ile reaksiyona iken, tip antisera, genel olarak, tek bir serotip (örneğin Tip 1 antiserum, serotip 1 ile reaksiyona giren) ile reaksiyona girer. Gruplar içindeki bazı serotip başka bir faktör, antisera (örneğin, serotip 22F faktör 22b ile reaksiyona girer, ancak 22c) kullanılarak ayrılır. Serotip 19, 20, tespit edilene kadar, bu durumda test ilgili tüm etken antisera ile devam edilir. Reaksiyon, kapsül şişme deneyi basit ve 14 hızlı ve herhangi bir l yapılabiliraboratory bu iyi kaliteli mikroskop antiserumlar ve uygun bir dizi ile donatılmıştır.
Bu teknikte kritik bir safha, saf kültür çorbasına bakteriyel hücrelerin uygun bir sayısı ile birlikte ekleme süspansiyonunu hazırlamak için kullanılır sağlamaktır. Bu agar plakaları üzerinde büyüme ve koloni morfolojisi, farklı pnömokok izolatı arasında değişmekte olduğu not edilmelidir. Bazı döngü ile kapalı almak için ve suyu iyi emülsifiye olmayan zor olabilir, kuru ve sert koloniler üretir. Hücre süspansiyonunun hazırlanması, bu nedenle, bakterilerin daha büyük bir tarama gerekebilir. Her durumda, bu göreceli boyutu antisera olan hücreler ile karşılaştırıldığında, böylece tek tek hücreler, ve agregalar, negatif kontrol olarak ilave ortada şarttır. Buna ek olarak, çok sayıda bakteri hücreleri kapsül antijeninin fazla kapsül şişme deneyi reaksiyonu 10 inhibe edebilir bir yanlış negatif tepkimeye neden olabilir. Bu nedenle, uygun bir hücre yoğunluğuna sahip bir bakteriyel süspansiyon (Şekil 1) oluşturmak için önemlidir. Suspansiyon konsantre edilmiş, formalin birkaç damla eklenmesi ile birkaç ay boyunca muhafaza edilebilir. Bu kolay toplu testini sağlar ve aynı zamanda laboratuvar kaynaklı enfeksiyonların riskini azaltarak suyu sterilize, bu zehirli, aşındırıcı, kanserojen, duyarlılaştırılmaları ve yanıcı taşıma formalin güvenlik riskine karşı tartılır olmalıdır rağmen. Buna ek olarak, bazı izolatlar formalin (veriler gösterilmemiştir) mevcudiyetinde tepkileri zayıf olduğunu gözlemledik.
Kapsül şişme deneyi reaksiyonları bir mikroskop kullanılarak incelenir. Faz kontrast kullanılması, kapsülün görünürlüğünü artırır. Bazı laboratuarlarda, reaksiyon 1,000 X büyütme 14, 16 petrol-batırma kullanılarak izlenebilir. Buna ek olarak, bazı laboratuar ayrıca bir pozitif reaksiyon 10, 16, 22 görünürlüğünü artırmak için bir karşı leke (metilen mavi) kullanın. Burada sunulan yöntem, yağ-i olmaksızın görülüyormmersion ve 400X büyütme 15, 17 altında. Bu yöntem, hızlı, basit ve 23, okumak için nispeten kolaydır.
Bu antiserumlar ve test prosedürleri sırayla sağlamak için iyi bir iç kalite kontrol prosedürleri korumak için önemlidir. Bir dış kalite güvence programına katılım genellikle faydalıdır.
Pnömokok olarak serolojik tipleme için kapsül şişme deneyi reaksiyonun önemli bir sınırlama gerekli olan antiserumların yüksek maliyetidir. Bununla birlikte, bu durum, her bir reaksiyon için kullanılan antiserumun küçük bir miktarına gerek yukarıdaki protokol en aza indirilir. Diğer bazı yöntemler pnömokok 23, 24 serotip için tarif edilmiştir. Ancak, kapsül şişme deneyi altın standart olmaya devam etmektedir ve yeni yöntemlerin geliştirilmesi kapsül şişme deneyi reaksiyonu 23 karşı standardizasyonu gerektirir. Uygun anti-serumlar kullanılarak, reaksiyon, kapsül şişme deneyi başka kapaklar belirlemek ve yazmak için kullanılabilirule bakteri 25 üretir. Kapsül şişme deneyi reaksiyon mevcut ve gelişmekte olan pnömokok serotipleri karakterizasyonu, yanı sıra aşı etkinliği ve taşıma ve hastalık üzerine aşılamanın uzun vadeli etkileri hakkında bilgi veren vesile oluyor.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı (PneuCarriage proje, Grant 52099) ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından desteklenmiştir. Eileen Dunne, Janet Strachan, ve yazının eleştirel okuma için Kim Hare teşekkürler.
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |