תגובת Quellung היא טכניקת תקן זהב עבור serotyping Streptococcus pneumoniae. טכניקה זו מנצלת מיקרוסקופ ונסיובי pneumococcal הספציפי ומשמשת בדרך כלל התייחסות ומעבדות מחקר ברחבי העולם.
ישנם מעל 90 קפסיד שונים קופסית של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). כמו גם להיות כלי להבנת האפידמיולוגיה pneumococcal, serotyping קופסית יכול לספק מידע שימושי למחקרי יעילות חיסון והשפעה. תגובת Quellung היא שיטת תקן זהב עבור serotyping קופסית ריאות. השיטה כרוכה בבדיקת השעיה תא pneumococcal עם נסיובי נקווה וספציפי המכוונים נגד פוליסכריד קופסית. תגובות נוגדן אנטיגן הם נצפו במיקרוסקופ. יש הפרוטוקול שלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של השעיה תא חיידק, 2) ערבוב של תאים ונסיובי בשקופית זכוכית, ו 3) קריאת תגובת Quellung באמצעות מיקרוסקופ. תגובת Quellung היא פשוטה למדי לביצוע ויכולה להיות מיושמת בכל מקום במיקרוסקופ ונסיובי מתאים זמינים.
pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא אחראי למותם של 800,000 ילדים מוערכים מתחת לגיל חמש בשנה, עם הנטל של מחלה נופל בעיקר במדינות משאבים לעניים 1. מחלות דלקת ריאות טווח חומרה מזיהומים מקומיים כגון תקשורת אזנים חריפה לזיהומים מסכנים חיים קשים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח ודלקת ריאות 2. מעל 90 קפסיד קופסית של pneumococci תוארו 3, 4. חיסוני pneumococcal הנוכחיים מספקים הגנה מפני הזנים אל כי הם אחראים למרבית מחלות 5 פולשנית, 6. עם זאת, שימוש נרחב בחיסונים נקשר עם החלפת קפסיד הכלולים בחיסון מזני nonvaccine, הן בכרכרה האף והלוע ומחלה פולשנית 7, 8. זה מדגיש את החשיבות של serotyping לאפידמיולוגייםמעקב והשפעת חיסון לטווח ארוך לומדים 9.
שיטת תקן זהב עבור הקלדת pneumococcal היא מבחן התגובה קופסית, המכונה תגובת Quellung, שתואר לראשונה על ידי נויפלד ב1902 (ראה 10 אוסטריים). רמה גבוהה של התאמה נמצאה בין מעבדות, ובין תגובת Quellung ושיטות serotyping האחרות 11-13. יש כמה וריאציות של תגובת Quellung 10, 14-16. השיטה המתוארת כאן אינה דורשת שימוש בכתם דלפק או עדשת טבילת שמן, אלא ירידה של דגימה מוכנה היא מעורבת עם סרום ההקלדה ובדקה באופן מיידי בהגדלה 400X.
תגובת Quellung מבוצעת בדרך כלל באמצעות נסיובי זמין מסחרי. השיטה המתוארת כאן משתמשת בפחות נסיובי לעומת שיטות אחרות 16, 17, מה שהופך את זה יותר חסכוני. ברגע שIsolאכלתי מזוהה pneumococcus, הוא נבדק ברצף עם בריכות נסיובי עד תגובה חיובית הוא ציין. כל נסיוב בריכה מכיל תערובות שונות של נסיובי הועלו נגד 91 קפסיד pneumococcal 18. ברגע שהברכה הוקמה, סוג הפרט ונסיובי קבוצה שנכללים בבריכת התגובה נבדקים בנפרד ברצף. נסיובי סוג בדרך כלל מגיב עם סרוטיפ אחת (לדוגמא סוג נסיוב 1 מגיב עם סרוטיפ 1), ואילו נסיובי הקבוצה להגיב בכל קפסיד בקבוצה מסוימת (לדוגמא: קבוצת 22 נסיוב מגיב עם קפסיד 22F ו22A). הזנים אל חלק בתוך קבוצות נבדלים נוסף באמצעות נסיובי גורם (למשל סרוטיפ 22F מגיב עם 22b גורם, אבל לא 22c). במקרה זה בדיקה היא המשיכה עם כל נסיובי הגורם הרלוונטי עד סרוטיפ נקבע 19, 20. תגובת Quellung היא פשוטה ומהירה 14 וניתן לבצעו בכל ליטרaboratory כי הוא מצויד במיקרוסקופ באיכות טוב וסט מתאים של נסיובי.
שלב קריטי בטכניקה זו הוא להבטיח תרבות טהורה משמשת להכנת ההשעיה יחד עם הוספת מספר מתאים של תאים חיידקיים למרק. יש לציין כי צמיחת מושבה ומורפולוגיה על צלחות אגר משתנים בין מבודד pneumococcal שונה. כמה לייצר מושבות יבשות ומחוספסות, שיכול להיות קשה לבחור את עם לולאה ולא emulsify גם במרק. מסיבה זו, ייתכן שתהיה צורך בתנופה גדולה יותר של חיידקים בעת הכנת ההשעיה התא. בכל מקרה, זוהי חובתו של תאים בודדים, ולא אגרגטים, ברורים בביקורת השלילית כל כך הגודל היחסי שלהם יכול להיות בהשוואה לתאים עם נסיובי הוסיפו. בנוסף, יותר מדי תאי חיידקים עלולים לגרום לתגובה שלילית כוזבת, שבו עודף של אנטיגן קופסית עשוי לעכב את תגובת Quellung 10. מסיבה זו, חשוב ליצור השעיה חיידקים עם צפיפות תאים מתאימה (איור 1). Susפנסיה יכולה להישמר במשך מספר חודשים על ידי התוספת של כמה טיפות של פורמלין המרוכז. זה מאפשר בדיקות אצווה קלים יותר וגם מעקר את מרק הפחתת הסיכון לזיהומים נרכש במעבדה, אם כי זה חייב להישקל מול סיכוני הבטיחות של פורמלין טיפול, שהוא רעיל ומאכל, מסרטנים, רגישות, ודליק. בנוסף, יש לנו ציינו כי חלק מבודד להראות תגובות חלשות יותר בנוכחות של פורמלין (מידע לא מוצג).
תגובות Quellung נבחנות באמצעות מיקרוסקופ. השימוש בניגוד שלב משפר את הנראות של הקפסולה. בחלק מהמעבדות, התגובה היא שנצפו באמצעות נפט טבילה ב1,000 הגדלה X 14, 16. בנוסף, חלק ממעבדות משתמשות כתם דלפק (מתילן כחול) כדי לשפר את הנראות של תגובה חיובית 10, 16, 22 נוסף. השיטה המוצגת כאן מוצגת ללא שמן-immersion ותחת הגדלה 400X 15, 17. שיטה זו היא מהירה, פשוט וקלה יחסית לקרוא 23.
זה חשוב לשמור על נהלי בקרת איכות פנימית טובים כדי להבטיח את נהלי נסיובי ובדיקות הם בסדר. השתתפות בתכנית אבטחת איכות חיצונית היא לעתים קרובות מועילה.
מגבלה העיקרית של תגובת Quellung לserotyping של pneumococci היא העלות הגבוהה של נסיובי הנדרש. עם זאת, זה ממוזער בפרוטוקול לעיל בשל הכמות הקטנה של נסיוב המשמשת לכל תגובה. בכמה שיטות אחרות כבר תיארו לserotyping pneumococci 23, 24. עם זאת, Quellung נשאר תקן הזהב ופיתוח השיטות חדשות דורש סטנדרטיזציה נגד תגובת Quellung 23. שימוש נסיובי המתאים, תגובת Quellung יכולה גם להיות מנוצל כדי לזהות ולהקליד כובעים אחריםULE ייצור חיידקים 25. תגובת Quellung היא סייע באפיון של זנים אל ריאות הנוכחיות ועתידית, כמו גם מתן מידע על יעילות חיסון ואת ההשפעה ארוך הטווח של חיסון בכרכרה ומחלות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (פרויקט PneuCarriage, גרנט 52099) ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. תודה לאיילין דאן, ג'נט Strachan, וקים הייר לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |