A reação Quellung é a técnica padrão ouro para sorotipagem Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza um microscópio e anti-soros específicos pneumocócica e é comumente usado em referência e laboratórios de pesquisa em todo o mundo.
Há mais de 90 diferentes sorotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Além de ser uma ferramenta para a compreensão da epidemiologia pneumocócica, sorotipagem capsular pode fornecer informações úteis para os estudos de eficácia da vacina e de impacto. A reação Quellung é o método padrão-ouro para pneumocócica sorotipagem capsular. O método envolve o teste de uma suspensão de células com anti-soros de pneumococos em pool e específico dirigido contra o polissacarídeo capsular. As reacções antigénio-anticorpo são observadas ao microscópio. O protocolo tem três passos principais: 1) preparação de uma suspensão de células bacterianas, 2) mistura de células e anti-soros sobre uma lâmina de vidro, e 3) a leitura da reacção de Quellung, usando um microscópio. A reacção de Quellung é razoavelmente simples de realizar e pode ser aplicada sempre que um microscópio e os anti-soros adequados estão disponíveis.
Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é responsável pela morte de cerca de 800 mil crianças menores de cinco anos de idade, anualmente, com o fardo da doença caindo predominantemente em países com poucos recursos 1. Doenças pneumocócicas variar em gravidade de infecções localizadas, como a otite média aguda a infecções fatais graves, como septicemia, meningite e pneumonia 2. Mais de 90 serótipos capsulares de pneumococos têm sido descritas 3, 4. Vacinas pneumocócicas actuais proporcionam protecção contra os serótipos que são responsáveis pela maioria das doenças invasivas 5, 6. No entanto, o uso difundido de vacinas tem sido associada com a substituição de serotipos incluídos na vacina por serotipos não vacinais, tanto na nasofaringe e doença invasiva 7, 8. Isso ressalta a importância de sorotipagem para epidemiológicavigilância e impacto da vacina a longo prazo estuda 9.
O método padrão-ouro para a digitação pneumocócica é o teste de reação capsular, conhecida como a reação Quellung, descrita pela primeira vez por Neufeld, em 1902 (ver austríaco 10). Foi encontrado um elevado grau de concordância entre laboratórios, e entre a reacção de Quellung e outros métodos de sorotipagem 11-13. Existem várias variações da reacção de Quellung, 10, 14-16. O método aqui descrito não requer a utilização de um contador de manchas ou a lente de imersão em óleo, em vez disso, uma gota de amostra preparada é misturada com o soro de tipagem e examinadas imediatamente sob uma ampliação de 400X.
A reacção de Quellung, é geralmente realizada usando anti-soros disponíveis comercialmente. O método descrito aqui utiliza anti-soros menos em comparação com alguns dos outros métodos 16, 17, tornando-se mais rentável. Uma vez que um isoladorComeram é identificado como um pneumococo, é sequencialmente testados com anti-soros piscinas até uma reacção positiva é observada. Cada soro piscina contém diferentes misturas de anti-soros produzidos contra 91 sorotipos de pneumococo 18. Uma vez que a piscina está estabelecido, o tipo de indivíduo e grupo anti-soros que são incluídos na associação reactiva são testados individualmente em sequência. Tipo soros geralmente reagem com um único sorotipo (por exemplo, tipo 1 soro reage com o sorotipo 1), enquanto que os anti-soros grupo reagir com todos os sorotipos de um grupo específico (por exemplo, Grupo 22 anti-soro reage com sorotipos 22F e 22A). Alguns sorotipos dentro dos grupos são mais diferenciadas com fator anti-soros (por exemplo sorotipo 22F reage com fator 22b, 22c, mas não). Neste caso o teste é continuado com todos os anti-soros factor relevante é determinada até serótipo 19, 20. A reacção de Quellung, é simples e rápida e 14 pode ser realizada em qualquer laboratory que está equipado com um microscópio de boa qualidade e um conjunto adequado de anti-soros.
Um passo essencial na presente técnica é garantir uma cultura pura é usado para preparar a suspensão, juntamente com a adição de um número adequado de células bacterianas para o caldo. Deve notar-se que o crescimento da colónia e morfologia em placas de agar varia entre os diferentes isolados de pneumococos. Alguns produzem colônias seca e áspera, o que pode ser difícil de apanhar com um laço e não emulsionar bem no caldo. Por este motivo, uma varredura maior de bactérias pode ser requerida quando se prepara a suspensão de células. Em qualquer dos casos, é imperativo que as células individuais e não agregados, são evidentes no controlo negativo assim o seu tamanho relativo pode ser comparado com as células com anti-soro adicionado. Para além disso, muitas células bacterianas podem resultar numa reacção de falso negativo, onde um excesso de antigénio capsular podem inibir a reacção de Quellung 10. Por esta razão, é importante criar uma suspensão de bactérias com uma densidade de células adequada (Figura 1). A suspensão pode ser preservado por vários meses com a adição de algumas gotas de formol concentrado. Isso permite que os ensaios de lote mais fácil e também esteriliza o caldo reduzir o risco de infecções adquiridas em laboratório, embora isso deve ser pesado contra o risco de segurança de lidar com formol, que é tóxico, corrosivo, cancerígenas, sensibilizando e inflamável. Além disso, observou-se que alguns isolados mostram reacções fracas na presença de formalina (dados não mostrados).
Reacções Quellung são examinados usando um microscópio. A utilização de contraste de fase aumenta a visibilidade da cápsula. Em alguns laboratórios, a reação é visto usando de imersão em óleo a 1.000 ampliação X 14, 16. Além disso, alguns laboratórios utilizam uma mancha contador (azul de metileno), para aumentar ainda mais a visibilidade de uma reacção positiva 10, 16, 22. O método aqui apresentado é visto sem óleo-immersion e sob aumento de 400X 15, 17. Este método é rápido, simples e relativamente fácil de ler 23.
É importante manter bons procedimentos de controle interno de qualidade para garantir que os procedimentos de anti-soros, testes estão em ordem. A participação em um programa de garantia de qualidade externa é muitas vezes benéfico.
Uma das principais limitações da reacção de Quellung para serotipagem de pneumococos é o elevado custo dos anti-soros é necessária. No entanto, este é minimizado no protocolo de cima, devido à pequena quantidade de anti-soro utilizado para cada reacção. Vários outros métodos têm sido descritos para serotipagem de pneumococos 23, 24. No entanto, Quellung continua sendo o padrão ouro eo desenvolvimento de novos métodos requer padronização contra a reação Quellung 23. Utilizando anti-soro apropriado, a reacção de Quellung, também pode ser utilizado para identificar e tipo de outros tampõesule bactérias produtoras 25. A reação Quellung é fundamental para a caracterização de sorotipos de pneumococo atuais e emergentes, bem como a prestação de informações sobre a eficácia da vacina e do impacto a longo prazo da vacinação no transporte e na doença.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (projeto PneuCarriage, Grant 52099) e Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria. Graças à Eileen Dunne, Janet Strachan, e Kim Hare para a leitura crítica do manuscrito.
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
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Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
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*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |