Summary

Флуоресценция<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) для локализации вирусов и эндосимбиотических бактерий в растений и насекомых тканей

Published: February 24, 2014
doi:

Summary

Мы описываем здесь простой флуоресценции в гибридизация (FISH) метод локализации вирусов и бактерий в насекомых и растительных тканей. Этот протокол может быть продлен для визуализации мРНК в целом горе и срезах.

Abstract

Флуоресценции в гибридизация (FISH) является имя, данное различными методами, обычно используемых для визуализации генных транскриптов в эукариотических клетках и могут быть дополнительно модифицированы, чтобы визуализировать другие компоненты в клетке, такие как инфекции с вирусами и бактериями. Пространственная локализация и визуализация вирусов и бактерий во время инфекционного процесса является важным шагом, который дополняет профилирование экспрессии эксперименты, такие как микрочипы и RNAseq в ответ на различные стимулы. Понимание пространственно-временных инфекции с этими агентами дополняет биологические эксперименты, направленные на понимание их взаимодействия с клеточными компонентами. Несколько методов для визуализации вирусы и бактерии, такие как системы гена-репортера или иммуногистохимических способов отнимают много времени, а некоторые ограничены работать с модельных организмов и включают сложные методики. РЫБЫ, что цели РНК или ДНК видов в клетке является относительно легко и быстро меняТПК для изучения пространственно-временной локализации генов и для диагностических целей. Этот метод может быть надежными и относительно легко реализовать, когда протоколы используют короткий гибридизации, коммерчески-приобретенные зондов, которые не являются дорогими. Это особенно надежной, когда пробоподготовка, фиксация, гибридизация и микроскопическая визуализация не связано с рядом сложных шагов. Здесь мы опишем протокол для локализации бактерий и вирусов в насекомых и растительных тканей. Метод основан на простого приготовления, фиксации и гибридизации насекомых тотальных препаратов и рассеченных органов или ручной частей установки, с 20 пар оснований короткие ДНК-зонды, конъюгированные с флуоресцентных красителей на их 5'-или 3'-концами. Этот протокол был успешно применен к ряду насекомых и растительных тканей, и могут быть использованы для анализа экспрессии мРНК или других РНК или ДНК видов в клетке.

Introduction

При изучении взаимодействия между растительных вирусов и других патогенов с их зараженных растений хозяев, важно, чтобы визуализировать патогены и их соответствующих нуклеиновых кислот в месте, независимо ли они вызывать отрицательные эффекты на их хозяев. Это особенно важно при изучении движения патогена внутри и между клеток растений. В месте локализации генных продуктов возбудителя является важным шагом, который дополняет другие подходы к изучению процесса патогенности. Многие патогены растений, особенно вирусы, передаются насекомыми, имеющие сложные и интимные взаимодействия с их переносчиков. Локализация этих вирусов в их векторов имеет важное значение для изучения путь для передачи, а также возможные сайты взаимодействия внутри вектора. Передача некоторых вирусов растений насекомых-векторная оказывается помощь эндосимбиотических бактерий, которые проживают в пределах этих насекомых. Чтобы лучше изучить передачу этих вирусов растений бу их векторы, важно также, чтобы визуализировать эндосимбиотических бактерии в целом, и тех, кто участвует в передачи вируса, в частности. Колокализации вирусных и эндосимбиотических бактерий Таким образом, желательно за расследование возможных связей между этими организмами в пределах своей насекомых хозяина. Помимо передачи вируса, эндосимбиотических бактерии влияют несколько аспектов биологии насекомых-переносчиков, тем самым пространственная локализация этих бактерий в течение насекомых представляет большой интерес и важность.

Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) является наиболее важным вирусное заболевание комплекс культивируемых помидор по всему миру 1-4. TYLCV это вирус флоэмы ограниченной и исключительно векторением по белокрылки Bemisia tabaci 5,6. Предложена модель, описывающая транслокацию begomoviruses в их белокрылки векторов было предложено 6-9. Два конкретных барьеров активно перешли мажорING этот circulative передач: средняя кишка / гемолимфы и гемолимфы / слюнных желез барьеры. Этот процесс передачи Предполагается, посредничестве неизвестных рецепторов, которые распознают вирус капсида. TYLCV, как полагают, чтобы пересечь B. tabaci средней кишки 6,10, и поглощается через первичный слюнной железы 6, прежде чем он будет введен в растение. В белокрылки гемолимфы, TYLCV взаимодействует с белком GroEL производимого насекомых вторичного эндосимбиотических бактерии Hamiltonella. Это взаимодействие обеспечивает безопасную перевозку TYLCV в гемолимфе, и защищает его от нападения насекомых иммунной системы 11. Hamiltonella и Portiera, первичный эндосимбионта из белокрылки, размещены в bacteriocytes, клетки насекомых, найденные в гемолимфе и дом эндосимбиотических бактерий 11. B. tabaci таит дополнительные эндосимбиотических бактерий, включая риккетсий, Arsenophonus, Wolbachia и Фричаеа, который может быть локализован внутри или за пределами bacteriocytes, и имеют различные эффекты на биологии насекомого 12.

Несколько докладов пытались изучить локализацию TYLCV в растениях и белокрылки с помощью трудоемких и дорогостоящих протоколов, таких как просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), антител и РНК на месте на микроскопическом толщиной разделе 10,13, недавнее исследование описано локализацию растительных вирусов внутри их растений и векторных хозяев, используя простой протокол 14. Здесь мы опишем простой протокол для локализации TYLCV в B. tabaci расчлененный midguts и слюнных желез, и в разделах получены из TYLCV-инфицированных растений. Мы дополнительно описывают локализацию Portiera, первичной эндосимбионта из B. tabaci, и его вторичные эндосимбионты Hamitonella, риккетсии и Arsenophonus. Этот протокол основан на использовании коротких ДНК-зондов, которыефлуоресцентно меченый на их 5'-конце и специфической гибридизации с комплементарными последовательностями в вирусных или бактериальных последовательностей генов. Обработка образца относительно легко и сигнал, полученный высоко специфичен. Описанный протокол может быть использован для локализации вирусы, бактерии и другие патогены в их растений, животных и насекомых хозяев, и может быть дополнительно использован для локализации мРНК в той или иной ткани.

Protocol

1. Генеральный белокрылка, завод, и вирусов Подготовка к FISH анализа Задняя B и Q биотипа белокрылки на хлопковых рассады (Gossypium Hirsutum Л. резюме. Ачала) и поддержания внутри насекомых-доказательство клетках и комнат роста при стандартных условиях 25 ± 2 ° C, относительной влажно…

Representative Results

Система учился в этой рукописи показано на рисунке 1 и включает зараженный растение с TYLCV, взрослый и нимфу белокрылки B. tabaci, а внутренняя анатомия белокрылки, показывая путь к TYLCV транслокации в насекомое. Рисунок 2 показывает двойной рыбы во взрослой белокрылки д…

Discussion

Протокол, описанный здесь для локализации вируса растений в ее растения-хозяина и вектора насекомых, и эндосимбиотических бактерий в их конкретном узле белокрылки, могут быть адаптированы для локализации других вирусов в растениях и даже в животных тканях. Кроме того, протокол может б…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

не Исследования в лаборатории Ганим поддержали исследовательского гранта не. 908-42.12/2006 от немецко-израильского фонда (МФП), грант №. IS-4062-07 от Соединенных Штатов-Израиль Двусторонней сельскохозяйственных исследований и развития фонда (бард), и исследовательский грант не. 884/07 от Израиля Science Foundation (ISF), чтобы МГ

Materials

Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

References

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

View Video