פלואורסצנציה<em> באתר</em> הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים
Summary
אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.
Abstract
הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא שם שניתן למגוון רחב של טכניקות המשמשות בדרך כלל להמחשת תעתיקי גנים בתאי אוקריוטים ויכול להיות שונה יותר לדמיין רכיבים אחרים בתא, כגון הידבקות בוירוסים וחיידקים. לוקליזציה ויזואליזציה של וירוסים וחיידקים, במהלך תהליך ההדבקה המרחבי היא צעד חיוני שמשלים ניסויי פרופיל ביטוי כגון microarrays וRNAseq בתגובה לגירויים שונים. הבנת זיהומי spatiotemporal עם סוכנים אלה משלים ניסויים ביולוגיים להבנת האינטראקציה שלהם עם מרכיבים תאיים. כמה טכניקות להדמית וירוסים וחיידקים כגון מערכות גן כתב או שיטות immunohistochemical הן זמן רב, וחלקם מוגבלים לעבודה עם אורגניזמים מודל וכרוכים במתודולוגיות מורכבות. FISH, כי מטרות מיני RNA או DNA בתא הוא לי קל ומהיר יחסיתthod ללימוד לוקליזציה spatiotemporal של גנים ולמטרות אבחון. שיטה זו יכולה להיות חזקה וקלה יחסית ליישום, כאשר הפרוטוקולים להעסיק הכלאה קצרה, חלליות מסחריות שנרכשו, שאינן יקרים. זה חזק במיוחד כאשר הכנת מדגם, קיבעון, הכלאה, ולהדמיה מיקרוסקופית אינן כרוך בפעולות מורכבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללוקליזציה של חיידקים ונגיפים ברקמות חרקים וצמחים. השיטה מבוססת על הכנה פשוטה, קיבעון, והכלאה של mounts כל חרקים ואיברים מבותרים או חלקי צמח בעבודת יד, עם 20 זוגות בסיסי בדיקות דנ"א קצרים מצומדת לצבעי ניאון על 5 'או 3' שלהם מסתיימת. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר רקמות חרקים וצמחים, והוא יכול לשמש כדי לנתח את הביטוי של mRNAs או מיני RNA או DNA אחרים בתא.
Introduction
כאשר לומדים את יחסי הגומלין בין וירוסי צמח ופתוגנים אחרים עם המארחים הצמח הנגועים שלהם, זה חשוב כדי להמחיש את גורמי המחלה וחומצות הגרעין שלהם באתר, ללא קשר אם הם גורמים להשפעות שליליות על מארחיהם. זה חשוב ביותר כאשר לומד תנועת הפתוגן בתוך ובין תאי צמח. בלוקליזציה באתרו של תוצרי גנים של הפתוגן הוא צעד חיוני שמשלים את גישות אחרות ללימוד תהליך פתוגניות. פתוגנים צמח רבים, בעיקר וירוסים, המועברים על ידי חרקים, שיש יחסי גומלין מורכבים ואינטימיים עם הווקטורים שלהם. לוקליזציה של וירוסים אלו בווקטורים שלהם היא חשובה ללימוד בדרך לשידור, ואתרי אינטראקציה האפשריים בתוך הווקטור. העברת של וירוסים מסוימים צמחים וקטורי חרקים נעזרת בחיידקי endosymbiotic הנמצאים בתוך חרקים אלה. כדי לחקור את העברת וירוסי צמח ב האלה טובים יותרy הווקטורים שלהם, הוא גם חיוני כדי להמחיש את חיידקי endosymbiotic באופן כללי, ואלה שהיו מעורבים בהעברת נגיף, בפרט. Colocalization של חיידקי הווירוסים וendosymbiotic וכך רצוי לחוקר את הקשרים האפשריים בין אורגניזמים אלה בתוך מארח החרק שלהם. מלבד העברת נגיף, חיידקי endosymbiotic להשפיע על מספר היבטים של הביולוגיה של וקטורי חרקים, לוקליזציה וכך המרחבי של חיידקים אלה בחרקים היא של ריבית גבוהה וחשיבות.
וירוס סלסול עלים צהובים עגבניות (ירליות) (Begomovirus, Geminiviridae) הוא מורכב החשובה ביותר נגיפית המחלה של עגבניות מעובדות בעולם 1-4. ירליות היא וירוס מוגבל השיפה והווקטורים באופן בלעדי על ידי Bemisia tabaci כנימות 5,6. מודל המתאר את טרנסלוקציה של begomoviruses בוקטורי כנימותיהם הוצע 6-9. שני מחסומים ספציפיים הם חצו באופן פעיל during שידור circulative זה: midgut / hemolymph ומחסומי בלוטת hemolymph / רוק. תהליך העברת זה השערה הוא שמתווך על ידי קולטנים ידועים אשר מזהים את הקופסית הווירוס. הוא חשב ירליות לחצות ב ' midgut tabaci 6,10, והוא נספג דרך בלוטת הרוק העיקרית 6 לפני שהוא מוזרק לתוך הצמח. בhemolymph הכנימות, ירליות אינטראקציה עם חלבון GroEL מיוצר על ידי חיידק endosymbiotic המשני החרקים Hamiltonella. אינטראקציה זו מבטיחה הובלה בטוחה של ירליות בhemolymph, ומגנה עליו מפני התקפה של המערכת החיסונית החרקים 11. Hamiltonella וPortiera, endosymbiont העיקרי של כנימות עש, הם שוכנו בbacteriocytes, חרק תאים הנמצאים בחיידקי hemolymph וendosymbiotic בית 11. B. tabaci נמלי חיידקי endosymbiotic נוספים כולל Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, ופריטשEA, אשר יכול להיות מקומי בתוך או מחוץ לbacteriocytes, ויש להם השפעות מגוונות על הביולוגיה של החרקים 12.
מספר דיווחים, ניסו ללמוד את הלוקליזציה של ירליות בצמחים וכנימות עש באמצעות פרוטוקולים זמן רב ויקרים, כגון הילוכים מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM), נוגדנים ו-RNA באתרם על סעיף בעובי מיקרוסקופי 10,13, מחקר שנערך לאחרונה תאר את הלוקליזציה של וירוסי צמח בתוך המארחים הצמח ווקטור שלהם על ידי שימוש בפרוטוקול פשוט 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ללוקליזציה של ירליות בB. tabaci גזור midguts ובלוטות רוק, ובסעיפים שהוכן מצמחים נגועים ב-ירליות. בנוסף, אנו מתארים את הלוקליזציה של Portiera, endosymbiont העיקרי של B. tabaci, וendosymbionts המשני שלה Hamitonella, Rickettsia וArsenophonus. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש בבדיקות דנ"א קצרים, כישכותרתו fluorescently ב -5 בסופו של הדבר 'שלהם, ובאופן ספציפי להכליא רצפים משלימים ברצפי גנים נגיפיים או חיידקים. עיבוד הדגימה הוא קל יחסית ואת האות המתקבלת היא מאוד ספציפית. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי למקם וירוסים, חיידקים ומזיקים אחרים במארחי צמחים, בעלי החיים וחרקיהם, והוא יכול עוד לשמש בתרגום ה-mRNA בכל רקמה נתון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן ללוקליזציה של וירוס צמח במארח מפעלה ווקטור חרקים, חיידקים וendosymbiotic במארח הכנימות הספציפיים שלהם, יכול להיות מותאם ללוקליזציה של וירוסים אחרים בצמחים ואפילו ברקמות של בעלי חיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי למקם חיידקים פתוגניים endosymbiotic ומי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדה גאנם נתמכה על ידי מענק מחקר לא. 908-42.12/2006 מהקרן הגרמנית ישראלית (GIF), מענק לא. IS-4062-07 מארצות הברית וישראל דו הלאומית קרן החקלאות ארצות המחקר ופיתוח (BARD), ומענק מחקר לא. 884/07 מקרן הלאומית למדע (ISF) לMG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
