蛍光<em>その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための>ハイブリダイゼーション（FISH）
Summary
ここではin situハイブリダイゼーションの単純な蛍光（FISH）昆虫や植物組織中のウイルスや細菌の局在のための方法を説明します。このプロトコルは、全体のマウントおよび顕微鏡用切片におけるmRNAの可視化のために拡張することができます。
Abstract
in situハイブリダイゼーション （FISH） の蛍光は、一般に、真核細胞における遺伝子転写産物を可視化し、さらに、ウイルスや細菌による感染などの細胞内の他のコンポーネントを視覚化するために修飾することができるために使用される技術の様々に与えられた名称である。空間的局在および感染プロセス中のウイルスや細菌の可視化は、様々な刺激に応答してそのようなマイクロアレイおよびRNAseqとして発現プロファイリング実験を補完する重要なステップです。これらの試薬を用いた時空間の感染症を理解することは、細胞成分との相互作用を理解することを目的とした生物学的な実験を補完するものです。このようなレポーター遺伝子システムまたは免疫組織化学的方法などのウイルスおよび細菌を視覚化するためのいくつかの技術は時間がかかり、そしていくつかはモデル生物で動作し、複雑な方法論を含むよう限定される。細胞内のRNAまたはDNA種を対象としたFISHは比較的容易で、速い私です遺伝子の時空間局在を研究するための診断目的のためにTHOD。この方法は、堅牢でプロトコルは高価ではありません短いダイズ、商業的に購入したプローブを用いた場合に実施するのが比較的簡単にすることができます。試料調製、固定、ハイブリダイゼーション、および顕微鏡的視覚化は、複雑な工程を含まない場合に特に強固である。ここでは、昆虫や植物組織中の細菌やウイルスの局在化のためのプロトコルを記述します。この方法は、その5 'または3'末端に蛍光色素に結合させ20塩基対の短いDNAプローブを用いた簡単な準備、固定、および昆虫ホールマウントし、解剖し臓器や手作りの植物切片のハイブリダイゼーションに基づいています。このプロトコルは、正常昆虫および植物組織の数に適用されており、細胞内のmRNAもしくは他のRNAまたはDNA種の発現を分析するために使用することができる。
Introduction
それらの感染植物宿主と共に植物ウイルスおよび他の病原体の間の相互作用を研究するとき、それらはそれらの宿主に悪影響を引き起こすかどうかにかかわらず、 その場での病原体及びそれらのそれぞれの核酸を可視化することが重要である。植物細胞内病原体との間の動きを研究する場合に最も重要である。病原体の遺伝子産物のin situ局在化において病原性プロセスを研究するための他のアプローチを補完する重要なステップである。多くの植物病原体、特にウイルスは、それらのベクトルとの複合体との親密な相互作用を持つ、昆虫によって送信される。そのベクターでは、これらのウイルスの局在は、伝送のための経路、およびベクトル内部の可能な相互作用部位を研究するために重要である。いくつかの昆虫ベクトル化植物ウイルスの送信は、これらの昆虫内に存在する共生細菌によって助けられる。よりよいこれらの植物ウイルスBの送信を研究するために、yは、それらのベクターは、それは、特に、一般的な共生細菌およびウイルス伝播に関与するものを視覚化することも重要である。ウイルスや共生細菌の共局在は、このように彼らの昆虫宿主内でこれらの生物間の可能性のある関係を調査のために望ましい。脇にウイルスを送信してから、共生細菌が昆虫のベクターの生物学のいくつかの側面に影響を与え、昆虫内でのこれらの細菌のこのような空間局在は、高い関心と重要である。
トマト黄化葉巻ウイルス （TYLCV）（ベゴモウイルス、Geminiviridae）は、世界中で栽培トマト1-4の中で最も重要なウイルス性疾患の複合体である。 TYLCVは師部限定のウイルスであり、独占的にコナジラミコナジラミコナジラミ 5,6によってベクトル化されている。そのコナジラミのベクターにbegomovirusesの移行を記述するモデルは6-9提案されている。二つの具体的な障壁は、積極的にDUR交差している腸/血リンパおよび血リンパ/唾液腺の障害：この循環送信をING。この送信処理は、ウイルスキャプシドを認識し、未知の受容体によって媒介されると仮定される。 TYLCVはBを横断すると考えられているコナジラミの腸6,10、それが植物内に注入する前に、プライマリ唾液腺6を介して吸収される。コナジラミ血リンパでは、TYLCVは昆虫の二次共生細菌Hamiltonellaによって生成のGroELタンパク質と相互作用する。この相互作用は、血リンパにTYLCVの安全な輸送を確保し、昆虫の免疫系11。HamiltonellaとPortiera、一次細胞内共生による攻撃から保護するコナジラミの、bacteriocytes、血リンパやハウス内共生細菌11で見つかった昆虫細胞内に収容されている。B.コナジラミはリケッチア、Arsenophonus、ボルバキアとフリッチュ含む追加の共生細菌を保有bacteriocytes内側または外側に局所化することができ、EAは、昆虫の生物学12に多様な効果を持っている。
いくつかの報告が微小厚部10,13上にその場で 、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）、抗体およびRNAのような時間がかかり、高価なプロトコルを用いて植物およびコナジラミにおけるTYLCVの局在化を研究するために試みられているが、最近の研究では、局在化を記載単純なプロトコル14を使用して、彼らの工場とベクトルのホスト内部の植物ウイルスの。ここでは、BのTYLCVの局在化のための単純なプロトコルを記述タバココナジラミは、中腸と唾液腺を解剖して、セクションでTYLCVに感染した植物から調製した。我々はさらにPortiera、Bの一次細胞内共生の局在を説明コナジラミ、およびその二次共生Hamitonella、リケッチアおよびArsenophonus。このプロトコルは、短いDNAプローブを用いることに基づくということです蛍光5 '末端に標識され、具体的には、ウイルスまたは細菌の遺伝子配列中の相補配列にハイブリダイズされる。サンプル処理は比較的容易であり、得られた信号は、非常に特異的である。記載されたプロトコルは、それらの植物、動物および昆虫宿主においてウイルス、細菌および他の病原体を局在化するために使用することができ、さらに、任意の所与の組織中のmRNAを局在化するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
その具体的なコナジラミホストでの植物宿主と昆虫ベクターにおける植物ウイルスの局在のためにここで説明するプロトコル、および共生細菌は、植物であっても動物組織内の他のウイルスの局在に適応させることができる。さらに、プロトコルは、植物および動物系において共生および病原性細菌および他の微生物を局在化するために使用することができる。記載された方法は、短い、蛍?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ghanimラボでの研究は研究助成金なしでサポートされていました。ドイツ·イスラエル財団（GIF）から908-42.12/2006は、無許可する。 IS-4062から07米国 – イスラエル二国間農業研究と開発基金（BARD）、および研究助成金がないから。 MGにイスラエル科学財団（ISF）から884/07
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
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