Fluorescência<em> In situ</em> Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos
Summary
Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.
Abstract
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um nome dado a uma variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a visualização de transcritos de genes em células eucarióticas e pode ser ainda modificado para visualizar os outros componentes da célula, tais como a infecção com os vírus e as bactérias. Localização espacial e visualização de vírus e bactérias, durante o processo de infecção é um passo essencial que complementa a expressão profiling experiências como microarrays e RNAseq em resposta a diferentes estímulos. Compreender as infecções espaço-temporais com esses agentes complementa experiências biológicas destinadas a compreender a sua interação com componentes celulares. Várias técnicas para visualizar os vírus e as bactérias, tais como sistemas de gene repórter ou métodos imuno-histoquímicos são demoradas, e alguns estão limitados a trabalhar com organismos modelo e as metodologias complexas. PEIXES que tem como alvo de RNA ou DNA de espécies na célula é um me relativamente fácil e rápidoCTO para o estudo de localização espaço-temporal de genes e para fins de diagnóstico. Este método pode ser robusto e relativamente simples de implementar quando os protocolos empregar curto hibridação, as sondas comercialmente adquiridos, que não são caros. Isto é particularmente robusto, quando a preparação da amostra, a fixação, a hibridação, e a visualização microscópica não envolvem etapas complexas. Aqui nós descrevemos um protocolo para a localização de bactérias e vírus em tecidos de insetos e plantas. O método baseia-se na preparação simples, a fixação, e hibridação de insectos montagens inteiras e órgãos ou partes de plantas dissecadas feitos à mão, com 20 pares de bases de DNA sondas curtas conjugados com corantes fluorescentes na sua 5 'ou 3'. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de tecidos de insecto e vegetais, e pode ser usada para analisar a expressão de ARNm ou de outras espécies de RNA ou de DNA na célula.
Introduction
Ao estudar as interacções entre os vírus de plantas e outros organismos patogénicos com as suas plantas hospedeiras infectadas, é importante para visualizar os patógenos e seus respectivos ácidos nucleicos in situ, independentemente de causar efeitos negativos sobre os seus hospedeiros. Isto é muito importante quando se estuda o movimento patógeno dentro e entre as células de plantas. Localização in situ de produtos de genes do agente patogénico é um passo essencial que complementa outras abordagens para estudar o processo de patogenicidade. Muitos patógenos de plantas, principalmente os vírus, são transmitidas por insetos, com interações complexas e íntimas com seus vetores. A localização destes vírus em seus vectores é importante para estudar o caminho para a transmissão, e os possíveis locais de interacção no interior do vector. A transmissão de alguns vírus de plantas vetorizado por insetos é auxiliado por bactérias endosymbiotic que residem dentro desses insetos. Para melhor estudar a transmissão desses vírus de plantas by seus vectores, é também essencial para visualizar as bactérias endosymbiotic em geral, e aqueles que estão envolvidos na transmissão do vírus, em particular. Co-localização das bactérias e vírus endosymbiotic é assim desejado para investigar as possíveis relações entre esses organismos dentro de seu exército de insetos. Além da transmissão de vírus, bactérias endosymbiotic influenciar vários aspectos da biologia dos vectores de insecto, assim, a localização espacial destas bactérias dentro de insectos é de grande interesse e importância.
Tomato virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) é o complexo de doença viral mais importante do tomateiro cultivado em todo o mundo 1-4. TYLCV é um vírus limita-floema e é exclusivamente vetorizado pela mosca branca Bemisia tabaci 5,6. Um modelo que descreve a translocação de begomovirus nos seus vectores de mosca branca tem sido proposto 6-9. Duas barreiras específicas estão ativamente cruzou durção esta transmissão circulativa: o intestino médio / hemolinfa e as barreiras da glândula hemolinfa / salivares. Este processo de transmissão é a hipótese de ser mediada pelos receptores desconhecido, que reconhecem a cápside do vírus. TYLCV é pensado para atravessar B. tabaci intestino 6,10, e é absorvida através da glândula salivar primário 6 antes de ser injectado para dentro da fábrica. Na hemolinfa mosca branca, TYLCV interage com uma proteína GroEL produzido pela bactéria endossimbiótica secundária inseto Hamiltonella. Essa interação garante o transporte seguro de TYLCV na hemolinfa, e protege-lo de um ataque pelo sistema imunológico do inseto 11. Hamiltonella e Portiera, o endosymbiont primário de moscas brancas, estão alojados em bacteriocytes, células de insetos encontrados na hemolinfa e casa endosymbiotic bactérias 11. B. tabaci abriga bactérias endosymbiotic adicionais, incluindo Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia e FritschEA, que pode ser localizada no interior ou no exterior das bacteriocytes, e têm efeitos diversos sobre a biologia do insecto 12.
Vários relatórios têm tentado estudar a localização de TYLCV em plantas e moscas brancas, usando protocolos demorados e dispendiosos, como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM), anticorpos e RNA in situ na seção de espessura microscópica 10,13, um estudo recente descreveu a localização de vírus de plantas dentro de suas plantas hospedeiras e de vetor usando um protocolo simples 14. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para a localização de TYLCV em B. tabaci dissecado intestino médio e glândulas salivares, e nas seções preparados a partir de plantas TYLCV infectados. Descrevemos ainda mais a localização de Portiera, o endosymbiont primária de B. tabaci, e seus endossimbiontes secundárias Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Este protocolo é baseado no uso de sondas de DNA curtas, quesão marcadas por fluorescência em sua extremidade 5 ', e hibridam especificamente com sequências complementares em sequências de genes virais ou bacterianas. O processamento das amostras é relativamente fácil e que o sinal obtido é altamente específico. O protocolo descrito pode ser utilizado para localizar os vírus, bactérias e outros organismos patogénicos nas plantas, animais e insectos hospedeiros, e ainda pode ser utilizado para localizar o ARNm em qualquer dado tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito para a localização de um vírus de plantas, na sua planta hospedeira e vector de insecto, bactérias e endosymbiotic no seu hospedeiro mosca branca específico, pode ser adaptado para a localização de outros vírus em plantas e até mesmo em tecidos animais. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para localizar bactérias endosymbiotic e patogénicos e outros micro-organismos em sistemas de plantas e animais. Os métodos descritos dependem de conceito simples de hibridação entre uma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa no laboratório Ghanim foi apoiado por bolsa de pesquisa no. 908-42.12/2006 da Fundação Alemã-Israelense (GIF), conceder nenhuma. IS-4062-07 dos Estados Unidos-Israel Binacional Fundo das Nações Agrícola Pesquisa e Desenvolvimento (BARD) e bolsa de pesquisa no. 884/07 da Fundação para a Ciência Israel (ISF) para MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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