Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks
Summary
Doğrudan kalsiyum kıvılcım ölçülmesi için bir yöntem aşağıda tarif edilmiştir, Ca2 + elementer birim sağlam iskelet kas lifleri Sarkoplazmik retikulumdan bırakın. Bu yöntem, izole kas lifleri riyanodin reseptörü, Ca2 + serbest ozmotik stres-kaynaklı tetikleme kullanır. Dinamikleri ve hücre içi Ca 2 + sinyalizasyon homeostatik kapasitesi sağlığı ve hastalıkları, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Homeostatik Ca2 + sinyali bakımı canlı hücreler temel bir fizyolojik süreçtir. Ca 2 + kıvılcımlar gibi son derece sarkoplazmik retikulum (SR) membran kanalları yayınlayacak + (RyR) Ca riyanodin reseptörünün aracılık Ca 2 + serbest etkinlikler 2 lokalize görünen çizgili kas liflerinde sinyal + Ca 2 temel birimleridir. Uygun değerlendirme kas Ca 2 + kıvılcım sağlıklı ve hastalıklı çizgili kas hücre içi Ca2 + taşıma özellikleri hakkında bilgi verebilir. Ca 2 + olaylar yaygın olarak dinlenme kardiyomiyositlerde görülür kıvılcım rağmen, nadiren iskelet kas lifleri dinlenme gözlenmektedir, dolayısıyla iskelet kas lifleri kıvılcım oluşturmak ve analiz etmek için yöntemler için bir ihtiyaç vardır.
Burada ayrıntılı f kullanılarak izole fleksör digitorm brevis (FDB) kas lifleri Ca 2 + kıvılcım ölçmek için deneysel bir protokoldürluorescent Ca 2 + indictors ve lazer tarama konfokal mikroskopi. Bu yaklaşımda, izole edilmiş FDB lifler izotonik fizyolojik çözelti için bir dönüş ardından geçici hypoosmotic strese maruz kalmaktadır. Bu koşullar altında, sağlam bir Ca2 + cevabı sağlıklı genç FDB kas liflerindeki sarkolemmal zara bitişik tespit edilir kıvılcım. Altered Ca 2 + yanıtı distrofik veya yaşlı iskelet kas lifleri tespit edilir kıvılcım. Bu yaklaşım, son membran ile ayrılmış sinyal inositol arasındaki çapraz-(1,4,5)-trifosfat alıcısı (IP 3 R) ile ilgili olduğunu göstermiştir ve RyR Ca iskelet kasında 2 + kıvılcım etkinleştirme katkıda bulunur. Özetle, ozmotik stres kullanarak çalışmalarımız kaynaklı Ca 2 + kıvılcımlar bu hücre içi yanıt bir kas fizyolojisi mekanizması sinyalizasyon ve fare kas distrofi modelleri (mdx fare) veya Amyotrofik lateral skleroz (ALS modeli dahil / hastalık durumlarını, yaşlanma yansıtır gösterdi.)
Introduction
Hücre içi serbest Ca 2 + ([Ca 2 +] i) (inceleme için Stutzmann ve Mattson 1 bakınız) nöronlar, kalp, iskelet ve düz kaslar gibi uyarılabilir hücrelerde birden fazla hücre fonksiyonlarını düzenler, çok yönlü ve önemli bir ikincil habercidir. Sarkoplazmik retikulum (SR) ve T-tübül arasındaki Ca 2 + seferberlik ve diyafoniyi Ayarlı (TT) membranlar kas fizyolojisinin temel düzenleyiciler vardır. Ayrıca, Ca 2 + sinyal değişimler çeşitli kas hastalıklarında kontraktil fonksiyon bozukluğunun altta yatan mekanizma olduğu ortaya çıkmıştır.
Ca 2 + kıvılcımlar sarkoplazmik retikulum (SR) membran 2 riyanodin reseptörü (RyR) kanal açılması kaynaklanan ilköğretim Ca 2 + release olaylarını yerelleştirilmiş. Kalp kaslarında, kıvılcım bir Ca2 +-kaynaklı Ca 2 + rele ile RyR2 kanalın açıklığı içinden kendiliğinden oluşabilirase (CICR) mekanizması 3-5. Iskelet kasında, RyR1 kesinlikle TT zar, 6,7 gerilim sensörü ile kontrol edilir. Bozulmamış iskelet kas lifleri istirahat koşullarında Böylece Ca 2 + kıvılcımlar bastırılır ve nadiren tespit. + Iskelet kası 8,9 saptanabilir olayları kıvılcım Yakın zamana kadar, gerekli sarkolemmal zar RyR1 üzerindeki gerilim sensörünün bastırılması çözmek için çeşitli kimyasal veya mekanik "arayüz" yöntemlerle bozulduğu ve Ca 2 dir. Bir yöntem, daha önce saponin deterjan 10 ile kas liflerinin, zarın geçirgenliği gerekli tarif.
2003 yılında, biz geçici hypoosmotic stres veya hiperosmotik stres ya 2 + sağlam kas lifleri 11 sarkolemmal zara bitişik kıvılcım periferik Ca neden olabileceğini keşfetti. Bu yöntem beri Ca 2 + moleküler mekanizması ve modülasyon incelemek için modifiye edilmiş </sup> salma ve dinamikleri 12-16. Burada sağlam iskelet kasında Ca 2 + kıvılcım indüksiyon, algılama ve analiz için deneysel yaklaşımın ayrıntılarını açıklayacağım. Ayrıca, iskelet kası, örneğin kıvılcım frekans ve genliği RyR kanalların açık olasılığını ifade etmektedir (Δ F/F0, tek tek Ca 2 + kıvılcım temel özelliklerini ölçmek için kullanılabilen göre özel olarak yapılmış kıvılcım analiz programını ve SR içindeki Ca 2 + yük), pike geliş zamanı (yükselme zamanı) ve süresi (FDHM, kıvılcımlar yarı maksimal genliğinde tam süresi), hem de Ca 2 + kıvılcım uzamsal dağılımı. Buna ek olarak, bu tür kas distrofisi ve amiyotrofik lateral skleroz gibi iskelet kaslarında çeşitli patofizyolojik durumlarda, Ca 2 + kıvılcım değiştirilmiş bağlantılar kanıt sunar.
Bu tekniğin avantajı, nispeten elle çekilse içinde Ca 2 + ölçmek için yetenek gerektirirbunun yerine, kas lifleri sıyırma için fizyolojik koşullarda kayıt Ca 2 + kıvılcım yakın izin yaşlı hücreleri. Buna ek olarak, özel olarak tasarımlanmış bir program kas lifleri ile ilgili olarak kıvılcım özelliklerinin daha doğru hesaplamalar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sağlam iskelet kasında Ca 2 + kıvılcım değerlendirilmesi yöntemi kas fizyolojisi ve hastalık araştırma için yararlı bir araçtır. Biz, Ca 2 + kıvılcım yanıt 18, 19, hem de amyotrofik lateral skleroz 20 yaşlanma, kas distrofisi 11 de dahil olmak üzere, farklı koşullar içinde değiştirilmiş olduğunu gösterdi. Bizim son çalışmada da Ca iskelet kas lifleri 21 2 + kıvılcım aktivasyon katkıda kritik bir bileşeni tems…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma JM, RO1-AR063084to NLW ve JZ için RO1-AR057404 için RO1-AG028614 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Dissecting microscope | Dissect out fibers and check muscle integrity | ||
| Dissection tools -scissors, and fine tip forceps | Fine Science Tools | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | DOW CORNING | 184 SIL ELAST KIT | Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate. |
| 60-mm glass petri dish | Pyrex | 3160 | Fiber dissection |
| Isotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Minimal Ca2+ Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Hypotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| collagenase type I | Sigma-Aldrich | C-5138 | Fiber digestion |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluorescent Ca2+ imaging dyes |
| TMRE | Invitrogen | T669 | mitochondrial membrane potential fluorescent dyes |
| Delta TPG dishes | Bioptechs | 0420041500C | 35 mm glass bottom dish for imaging |
| Spark Fit software | data analysis software | ||
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | ||
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| temperature controllable orbital shaker | New Brunswick scientific | Fiber dissociation |
References
- Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease. Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium sparks. Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Brochet, D. X., et al. Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).
- Brochet, D. X., et al. Quarky calcium release in the heart. Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging calcium sparks in cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).
- Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target. Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).
- Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle. J. Physiol. 537, 379-389 (2001).
- Zhou, J., et al. A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).
- Zhou, J., et al. Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle. Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).
- Wang, X., et al. Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle. Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).
- Teichmann, M. D., et al. Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression. PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).
- Shkryl, V. M., et al. Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers. Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).
- Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).
- Weisleder, N., Ma, J. J. Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy. Acta. 27 (7), 791-798 (2006).
- Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers. Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).
- Weisleder, N., et al. Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release. J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).
- Yi, J., et al. Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling. J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).
- Tjondrokoesoemo, A., et al. Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle. J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).
- Martins, A. S., et al. Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).
- Apostol, S., et al. Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells. J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).
- Jiang, Y. L., et al. Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes. J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).
