Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Summary

Описанный здесь метод непосредственного измерения искры кальция, элементарные единицы Ca ^{2 +} освобождение от саркоплазматического ретикулума в неповрежденных скелетных мышечных волокон. Этот метод использует осмотического стресса опосредованного срабатывания Ca ^{2 +-релизе} рианодинового рецептора в изолированных мышечных волокон. Динамика и гомеостатический емкость внутриклеточного Ca ^{2 +-сигнализации} могут быть использованы для оценки функции мышц в норме и при патологии.

Abstract

Поддержание гомеостаза Са ^{2 +} сигналов является фундаментальным физиологический процесс в живых клетках. Ca ^{2 +} искры являются элементарными единицами Са ^{2 +-сигнализации} в поперечно-полосатой мышечных волокон, которые появляются, как сильно локализованы Ca ² события ⁺ релиз, опосредованные рианодинового рецептора (RyR) Са ^{2 +} освободить каналы на саркоплазматического ретикулума (СР) мембраны. Надлежащая оценка мышц Ca ^{2 +} искры может предоставить информацию о внутриклеточных Са ^{2 +} обработки свойств здоровых и больных поперечно-полосатых мышцах. Хотя Ca ^{2 +} искры события часто наблюдается в состоянии покоя кардиомиоцитов, они редко наблюдается в состоянии покоя скелетных мышечных волокон, таким образом существует потребность в способах для получения и анализа искры в скелетных мышечных волокон.

Детальный здесь экспериментальный протокол для измерения Ca ^{2 +} искры в изолированных сгибателей digitorm Brevis (FDB) мышечных волокон с помощью еluorescent Са ^{2 +} indictors и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. При таком подходе, изолированные волокна FDB подвергаются переходного гипоосмотического стресса с последующим возвращением к изотонического физиологического раствора. В этих условиях надежной Ca ^{2 +} искры ответ обнаружено, прилегающей к мембране сарколеммы у молодых здоровых мышечных волокон FDB. Измененные Са ^{2 +} искры ответ обнаружены в дистрофических или в возрасте скелетных мышечных волокон. Такой подход в последнее время показали, что мембрана, разделенных сигналов с участием перекрестные помехи между инозит (1,4,5)-трифосфат рецептор (IP ₃ R) и RyR способствует Ca ^{2 +} активации искра в скелетных мышцах. Таким образом, наши исследования с использованием осмотического стресса индуцированных Ca ^{2 +} искры показал, что это внутриклеточный ответ отражает мышцу механизм сигнализации в физиологии и старения Штаты / болезни, в том числе моделей мыши мышечной дистрофии (MDX мышей) или бокового амиотрофического склероза (БАС модели).

Introduction

Внутриклеточного свободного Са ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _я) является универсальным и важным второстепенным вестников, который регулирует несколько клеточных функций в возбудимых клеток, таких как нейроны, сердца, скелетной и гладкой мускулатуры (см. обзор Stutzmann и Mattson ^1). Регулируемый Ca ^{2 +} мобилизации и перекрестные помехи между саркоплазматического ретикулума (СР) и Т-канальцев (TT) мембраны являются фундаментальными регуляторы мышечной физиологии. Кроме того, изменения в Ca ^{2 +-сигнализации} уже было показано, что основной механизм сократительной дисфункции при различных заболеваниях мышц.

Ca ^{2 +} искры локализованы элементарных событий Са ^{2 +} релиз, происходящих из открытия рианодинового рецептора (RyR) канала на саркоплазматического ретикулума (СР) мембраны ^2. В сердечной мышце, искры возникают спонтанно через отверстие канала RyR2 с помощью Ca ^{2 +-индуцированных} Са ^{2 +} RELEASE (CICR) механизм ^3-5. В скелетных мышцах, RYR1 строго контролируется с помощью датчика напряжения на мембраны ^6,7 TT. Таким образом Ca ^{2 +} искры подавляются и редко обнаруживается в покоящихся условиях в неповрежденных скелетных мышечных волокон. До недавнего времени сарколемных мембрана необходима, чтобы быть нарушена различными химическими или механическими "Горное дело" методов расцепить подавление датчика напряжения на RYR1 и позволило Ca ^{2 +} искра события, которые будут обнаружены в скелетных мышцах ^8,9. Один способ, ранее описанный требуемого пермеабилизации мембраны мышечных волокон по сапонина моющего средства ^10.

В 2003 году мы обнаружили, что либо переходный стресс гипоосмотического или гиперосмотический стресс может вызвать периферическую Ca ^{2 +} искры рядом с сарколеммы мембраны интактных мышечных волокон ^11. Этот метод был модифицирован так как изучить молекулярный механизм и модуляцию Ca ^{2 +} </suр> релиз и динамика ^12-16. Здесь мы приводим детали нашего экспериментального подхода для индукции, обнаружения и анализа Ca ^{2 +} искр в неповрежденной скелетных мышцах. Мы также представляем наш специально построенный программу анализа свечу, которую можно использовать для количественного определения элементного свойства отдельных Ca ^{2 +} искр в скелетных мышцах, например свечи частоты и амплитуды (Δ F/F0, что отражает вероятность открытия каналов RyR и ⁺ нагрузка Са ² внутри СР); время до пика (время нарастания) и продолжительность (FDHM, полный срок в полумаксимальной амплитуды) искр, а также пространственное распределение Са ^{2 +} искр. Кроме того, мы представляем доказательства того, что ссылки изменен Ca ^{2 +} искры к различным патофизиологических состояний в скелетных мышцах, таких как мышечная дистрофия и боковой амиотрофический склероз.

Преимущество этой техники включает в себя возможность измерения Са ^{2 +} в относительно undamв возрасте клетки, вместо зачистки мышечные волокна, что позволяет записи Са ^{2 +} искры в условиях ближе к физиологическим. Кроме того, наша специально разработанная программа обеспечивает более точные расчеты свойств искры в отношении мышечных волокон.

Protocol

1. Настройка Осмотическое-стрессовой перфузии системы Фиг.1 представляет собой схематический протокол кальция искры оценку в интактных скелетных мышечных волокон. Настройка трехосный (XYZ) микроманипулятор способный позиционирует наконечник выпускной с?…

Representative Results

Более ранние исследования показали, что переходный гипоосмотического стресс, вызванный периферийных Ca 2 + искры рядом с сарколеммы мембраны интактных мышечных волокон 11. На рисунке 1 показаны образы неповрежденных отдельных мышечных волокон с гладкой мембраны сар…

Discussion

Это метод оценки Ca ^{2 +} искры в неповрежденном скелетных мышц является полезным инструментом для мышечной физиологии и исследования болезни. Мы показали, что Ca ^{2 +} искра ответ был изменен в различных условиях, в том числе мышечная дистрофия ^11, старение ^{_18, 19,} а т?…

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation