Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Summary

Descrito aqui é um método para medir diretamente faíscas de cálcio, as unidades elementares de Ca ^{2 +} liberação de retículo sarcoplasmático em fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica mediada por estresse disparo de Ca ^{2 +} liberação do receptor rianodina nas fibras musculares isoladas. A dinâmica ea capacidade homeostática de Ca ^{2 +} intracelular de sinalização pode ser empregada para avaliar a função do músculo na saúde e na doença.

Abstract

A manutenção da homeostase de ^{Ca2 +} de sinalização é um processo fisiológico essencial em células vivas. Ca ^{2 +} faíscas são as unidades elementares de Ca ^{2 +} de sinalização nas fibras musculares estriadas que aparecem como altamente localizada Ca ^{2 +} eventos de liberação de mediadas pelo receptor rianodina (RyR) Ca ^{2 +} liberar canais no retículo sarcoplasmático (RS) membrana. A avaliação adequada do músculo Ca ^{2 +} faíscas poderia fornecer informações sobre os intracelulares de ^{Ca2 +} propriedades de manipulação de músculos estriados saudáveis ​​e doentes. Apesar de Ca ^{2 +} faíscas eventos são comumente visto em cardiomiócitos de descanso, eles raramente são observados em repouso fibras musculares esqueléticas; portanto, há uma necessidade de métodos para gerar e analisar faíscas em fibras musculares esqueléticas.

Detalhado aqui é um protocolo experimental para a medição de Ca ^{2 +} faíscas isolado flexores digitorm brevis (FDB) fibras musculares usando fluorescent Ca ^{2 +} indicadores e microscopia confocal de varredura a laser. Nesta abordagem, as fibras FDB isolados são expostos ao estresse hiposmótico transitória seguida por um retorno à solução fisiológica isotônica. Sob estas condições, uma robusta Ca ^{2 +} faíscas resposta é detectada adjacente à membrana sarcolema em pequenas fibras musculares FDB saudáveis. Alterou Ca ^{2 +} faíscas resposta é detectada em distróficas ou envelhecidas fibras musculares esqueléticas. Essa abordagem tem demonstrado recentemente que a sinalização delimitado por membrana envolvendo conversa cruzada entre inositol (1,4,5) trifosfato de receptor de IP ₍₃ R) e RyR contribui para Ca ^{2 +} activação faísca no músculo esquelético. Em resumo, nossos estudos usando estresse osmótico induzido Ca ^{2 +} faíscas mostrou que esta resposta intracelular reflete um músculo sinalização mecanismo em fisiologia e envelhecimento estados / doença, incluindo modelos de ratos de distrofia muscular (MDX ratos) ou esclerose lateral amiotrófica (ALS modelo).

Introduction

Intracelular livre de ^{Ca2 + ([Ca2 +]} _i) é um mensageiro secundário versátil e importante que regula várias funções celulares em células excitáveis ​​como neurônios, cardíaco, esquelético e músculos lisos (para revisão ver Stutzmann e Mattson ^1). Regulamentado Ca ^{2 +} mobilização e cross-talk entre retículo sarcoplasmático (RS) e T-túbulo (TT) membranas são reguladores fundamentais da fisiologia muscular. Além disso, as alterações no ^{Ca2 +} sinalização tinha sido demonstrado ser um mecanismo subjacente da disfunção contráctil em várias doenças musculares.

Ca ^{2 +} faíscas são localizados eventos Ca ^{2 +} libertação elementares provenientes de abertura do receptor rianodina (RyR) canal no retículo sarcoplasmático (RS) membrana ^2. No músculo cardíaco, faíscas ocorrer espontaneamente através da abertura do canal RyR2 por uma CA ^{2 +} induzida por ^{Ca2 +} release (CICR) mecanismo ^3-5. No músculo esquelético, RyR1 é estritamente controlado pelo sensor de tensão na membrana ^6,7 TT. Assim, Ca ^{2 +} faíscas são reprimidas e raramente detectada em condições de repouso em fibras musculares esqueléticas intactas. Até recentemente, a membrana sarcolema necessário para ser rompidas por vários métodos químicos ou mecânicos "skin" para desacoplar a supressão do sensor de tensão em RyR1 e permitida para o Ca ^{2 +} desencadear eventos a serem detectados no músculo esquelético ^8,9. Um método anteriormente descrito é necessária a permeabilização da membrana das fibras musculares por detergente saponina ^10.

Em 2003, descobrimos que, ou o stress hipoosmótico transiente ou stress hiperosmótico poderia induzir Ca ^{2 +} faíscas periférica adjacente à membrana sarcolema em fibras musculares intactas ^11. Este método já foi modificado para estudar o mecanismo molecular e modulação de Ca ^{2 +} </sup> liberação e dinâmica ^12-16. Aqui destacamos os detalhes de nossa abordagem experimental para a indução, detecção e análise de Ca ^{2 +} faíscas no músculo esquelético intacto. Apresentamos também o nosso programa de análise de faísca custom-built que podem ser usados ​​para quantificar as propriedades elementares de Ca ^{2 +} faíscas individuais em músculo esquelético, por exemplo, freqüência de ignição e amplitude (Δ F/F0, o que reflete a probabilidade aberta dos canais RyR e a carga de ^{Ca2 +} para dentro do SR), o tempo até ao pico (tempo de subida) e duração (FDHM, a duração total de amplitude de metade do máximo) de faíscas, bem como a distribuição espacial de Ca ^{2 +} faíscas. Além disso, apresentamos evidências que ligam alterado Ca ^{2 +} fagulhas para os diversos estados fisiopatológicos no músculo esquelético, como a distrofia muscular e esclerose lateral amiotrófica.

A vantagem desta técnica envolve a capacidade de medir de Ca ^{2 +} em relativamente undamcélulas envelhecidas, em vez de descascar as fibras musculares, permitindo a gravação de Ca ^{2 +} faíscas em condições mais próximas fisiológica. Além disso, nosso programa concebido permite cálculos mais precisos das propriedades da faísca em relação às fibras musculares.

Protocol

1. Configurando osmótica-stress Sistema de Perfusão A Figura 1 é um diagrama esquemático de protocolo de cálcio faíscas avaliação em fibras musculares esqueléticas intactas. Defina-se um micromanipulador de três eixos (xyz) capaz de posicionar a ponta de saída do sistema de perfusão que contém um mínimo de dois canais. Isto poderia ser feito com o descartável barril Luer-seringa ligados com três – forma Luer – Lok torneira para li…

Representative Results

Estudos anteriores mostraram que a tensão induzida transitória hipoosmótico Ca 2 + faíscas periférica adjacente à membrana sarcolema em fibras musculares intactas 11. Figura 1 mostra as imagens das fibras musculares individuais intactas com membrana sarcolema lisa e estrias claras características. Figura 2 mostra típico de Ca 2 + faíscas (como imagens xy) foram induzidos por (100 seg) tratamento transitório com uma solução hiposmóti…

Discussion

Este método de avaliação de Ca ^{2 +} faíscas no músculo esquelético intacto é uma ferramenta útil para a fisiologia muscular e pesquisa da doença. Mostrámos que a resposta de Ca ^{2 +} de ignição foi alterada em diferentes condições, incluindo distrofia muscular ^{11 de} envelhecimento ^{18, _19,} bem como, na esclerose lateral amiotrófica ^20. Nosso estudo recente revelou também acoplamento funcional entre IP ₃ receptor e RyR representando …

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation