Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Summary

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Abstract

A hipertensão pulmonar é uma importante causa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Historicamente, tem sido importante estudo das vias de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso vascular em PASMC de feto de ovelha. Enquanto ovelhas fazer um excelente modelo de hipertensão pulmonar prazo, eles são muito caros e não têm a vantagem de manipulação genética encontrada em ratinhos. Por outro lado, a incapacidade de isolar PASMC de ratinhos era uma limitação significativa do referido sistema. Aqui descrevemos o isolamento de culturas primárias de rato PASMC de P7, P14, e P21 ratinhos usando uma variação da técnica descrita anteriormente de Marshall et al. ²⁶ que foi previamente utilizado para isolar PASMC rato. Estes PASMC murino representam uma nova ferramenta para o estudo das vias de sinalização no período neonatal. Resumidamente, uma suspensão de 0,5% (w / v) de agarose + 0,5% de partículas de ferro em meio M199 é infundida no leito vascular pulmonar através do ventrículo direito (VD). Opartículas de ferro são 0,2 m de diâmetro e não pode passar através do leito capilar pulmonar. Assim, as lojas de ferro nas pequenas artérias pulmonares (PA). Os pulmões são inflados com agarose, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para baixo com um ímã. Depois de colagenase (80 U / ml) e após dissociação do tratamento, os vasos são colocados numa placa de cultura de tecidos em meio M199 contendo 20% de soro fetal bovino (FBS), e antibióticos (meio completo M199) para permitir a migração de células para o prato de cultura . Esta placa inicial de células é uma mistura de 50-50 de fibroblastos e PASMC. Assim, o puxar para baixo procedimento é repetido várias vezes, para obter uma população mais puro e PASMC remover qualquer ferro residual. Identidade da célula do músculo liso é confirmado por imunocoloração para o bom miosina muscular e desmina.

Introduction

A hipertensão pulmonar é normal, durante a vida intra-uterina desde a placenta serve como o principal órgão de troca gasosa e apenas 10% do débito cardíaco é circulado através do leito vascular pulmonar. No útero, as pressões pulmonares são semelhantes às pressões sistémicas devido à resistência vascular pulmonar elevada . A progressão da gestação, há um rápido crescimento da pequena PA dentro do pulmão, preparação do feto para o aumento dramático no fluxo sanguíneo pulmonar que ocorre no momento do nascimento ^1. Quando a transição perinatal normal falhar em crianças de curto prazo ea termo, o resultado é a hipertensão pulmonar persistente do recém-nascido (HPP). HPP é uma síndrome clínica causada por diversas patologias subjacentes diferentes. No entanto, todas essas crianças compartilham aspectos fisiopatológicos comuns, tais como elevada resistência vascular pulmonar, hipoxemia e manobras da direita para a esquerda do fluxo de sangue através de conexões fetais persistentes, como a persistência do canal arterial ou paraamen ovale. HPP afeta 2-6 por 1.000 nascidos vivos e transmite um risco de 8-10% de mortalidade, bem como significativa a curto prazo e de longo prazo morbidade ^2. Além disso, os nascidos de muito baixo peso ao nascer prematuros podem desenvolver hipertensão pulmonar como conseqüência de sua doença pulmonar subjacente. A doença pulmonar subjacente mais comum dos prematuros é a displasia broncopulmonar (DBP). Não obstante o risco de DBP se correlaciona com a idade gestacional e peso ao nascer, ainda não está claro por que um subconjunto dessas crianças se desenvolve hipertensão pulmonar significativa e como tratar adequadamente essas crianças. Maus resultados, incluindo a internação prolongada e aumento da mortalidade, são comuns ^3-6.

Historicamente, PASMC fetais ovinos ou PASMC fetal de suíno de animais saudáveis ​​têm sido usados ​​para estudar as vias de sinalização envolvidos na transição vascular pulmonar normal após o nascimento. Estes são tipicamente isoladas a partir de resistência à quinta geração de um PAn ovina e suína feto que é entregue e sacrificados antes de qualquer respiração espontânea ^7-9. Além disso, alguns pesquisadores têm isolado e utilizado PASMC de um pouco mais velha e com respiração espontânea cordeiros e leitões em 3 dias, 2 semanas e 4 semanas ^10-12. Mais recentemente, alguns grupos isolados e utilizados PASMC isolado cordeiros com HPP para examinar os distúrbios em vias de sinalização no estado de doença ^13-17 com sucesso. Estas células têm provado ser uma ferramenta valiosa para examinar as vias de sinalização que são cruciais tanto na vasculatura pulmonar normal e doente a curto prazo e longo prazo. No entanto, eles não dar dicas sobre as vias de sinalização afetadas em prematuros com hipertensão pulmonar. Além disso, não permitir que as possibilidades de manipulação genética observada em modelos do rato da doença.

Modelos de ratos e camundongos têm sido muito utilizados para modelar BPD e, mais recentemente, estão sendo usados ​​para hy pulmonar modeloarterial sistêmica resultante do DBP ^18-22. Ratos recém-nascidos são atraentes para trabalhar devido ao seu tamanho maior, mas eles também sofrem com a falta de potencial de modificação genética. Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para investigar os efeitos de genes alvos específicos sobre a fisiologia animal inteiro em camundongos recém-nascidos, mas até agora ninguém foi previamente isolada com sucesso PASMC destes pequenos ratos. Ao isolar PASMC, maior informação pode ser obtida sobre como alterar as vias em resposta a estímulos ambientais e / ou a modificação genética específica no músculo liso da artéria pulmonar. Além disso, ao vivo PASMC podem ser visualizados em tempo real para examinar as mudanças rápidas nas principais moléculas sinalizadoras, como cálcio e espécies reativas de oxigênio ^23-25. Recentemente, descreveram o isolamento de PASMC de ratinhos adultos utilizando uma variação da técnica de Marshall et al. ²⁶ utilizada para isolar rato PASMC ^23,25,26. Temos, agora, adaptado aª estendeu esta técnica para pequenos ratos 7-21 dias de idade (P7, P14 e P21). A principal limitação a esta nova técnica de isolamento PASMC é que requer múltiplos ratinhos para gerar suficientes células para as experiências e as células que crescem muito lentamente, o que é característico de células primárias de músculo liso. Apesar destas limitações, acreditamos que esta técnica para isolar PASMC neonatal mouse irá permitir a maior investigação das vias de sinalização importantes envolvidos no desenvolvimento da hipertensão pulmonar, e representa um avanço significativo nesta matéria.

Protocol

O Animal Care Institucional e Comitê de uso da Northwestern University aprovou este protocolo. 1. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos – Day One Prepare os completos M199 mídia – Misturar 400 ml M199 com 100 ml (concentração final = 20%) de calor FBS inativado e 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina. Preparar o soro grátis M199 Media – Misture 500 ml M199 com 5 ml (concentração final = 1%) penic…

Representative Results

Durante e após o isolamento, PASMC sejam apreciados por microscopia óptica e por imunocoloração para os marcadores de células musculares lisas. Por microscopia de luz no início do protocolo, PASMC são vistas migrar para o prato de cultura de tecido a partir do pequeno contendo ferro vasos (Figura 1A). Depois partilha placas de um a três no dia treze, então partículas de ferro não são mais vistos como aqueles têm sido puxado para fora na etapa final pooling. Em vez disso, uma população de …

Discussion

Neste artigo, descreve pela primeira vez o isolamento de PASMC de ratinhos em P7, P14 e P21. A fim de realizar isto, uma suspensão de agarose e 0,2 uM partículas de ferro são infundidas através de RV no PA. Devido ao pequeno tamanho das partículas de ferro, que não podem passar através do leito capilar pulmonar e assim, são depositados na pequena PA. Os pulmões são inflados, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para fora da solução usando um imã. Finalmente, os vasos foram plaquead…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.