We hebben een nieuwe en reproduceerbare techniek om primaire culturen van pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC) isoleren van muizen zo jong als P7 ontwikkeld, waardoor een betere studie van de signaalwegen betrokken bij neonatale gladde spiercellen samentrekken en ontspannen mogelijk.
Pulmonale hypertensie is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij zuigelingen. Historisch gezien, is er sprake van aanzienlijke studie van de signaalwegen betrokken bij vasculaire gladde spiercontractie in PASMC uit foetaal schapen. Terwijl schapen een uitstekende model duur pulmonale hypertensie, ze zijn erg duur en niet de voordelen van genetische manipulatie in muizen. Omgekeerd, het onvermogen om PASMC isoleren van muizen was een belangrijke beperking van dit systeem. Hier beschrijven we de isolatie van primaire kweken van muizen PASMC van P7, P14 en P21 muizen met een variant van de eerder beschreven techniek van Marshall et al.. 26 die eerder werd gebruikt voor rat PASMC isoleren. Deze muizen PASMC vormen een nieuw instrument voor de studie van signaalwegen in de neonatale periode. Kort, een suspensie van 0,5% (w / v) agarose + 0,5% ijzerdeeltjes in M199 medium wordt toegediend in de pulmonale vasculaire bed via de rechter ventrikel (RV). Deijzerdeeltjes zijn 0,2 micrometer in doorsnede en kan niet door de pulmonale capillaire bed. Zo is het ijzer lodges in de kleine longslagaders (PA). De longen worden opgeblazen met agarose, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden naar beneden getrokken met een magneet. Na collagenase (80 U / ml) behandeld en na dissociatie, worden de kolven op een weefselkweekschaal in M199 medium met 20% foetaal bovine serum (FBS) en antibiotica (M199 complete media) gebracht celmigratie doorlaat tot de kweekschaal . Deze eerste plaat van cellen is een 50-50 mengsel van fibroblasten en PASMC. Aldus wordt de pull down procedure meerdere malen herhaald om een meer pure PASMC bevolking te bereiken en verwijder eventueel resterende ijzer. Gladde spiercellen identiteit wordt bevestigd door immunokleuring voor gladde spieren myosine en desmine.
Pulmonale hypertensie is normaal tijdens intrauterine leven omdat de placenta fungeert als het belangrijkste orgaan van gasuitwisseling en slechts 10% van het hartminuutvolume wordt gecirculeerd door de pulmonaire vasculaire bed. In utero, pulmonale drukken zijn vergelijkbaar met systemische druk vanwege verhoogde pulmonale vaatweerstand . Als zwangerschap vordert, is er een snelle groei van de kleine PA binnen de longen, de voorbereiding van de foetus voor de dramatische stijging van de doorbloeding van de longen die optreedt bij de geboorte 1. Wanneer de normale perinatale overgang faalt in korte termijn en voldragen kinderen, het resultaat is persisterende pulmonale hypertensie van de pasgeborene (PPHN). PPHN is een klinisch syndroom dat wordt veroorzaakt door verschillende onderliggende pathologie. Echter, al deze kinderen hebben gemeenschappelijke pathofysiologische kenmerken, zoals verhoogde pulmonale vaatweerstand, hypoxemie, en rechts-naar-links-shunting van de bloedstroom in heel hardnekkige foetale verbindingen zoals de ductus arteriosus of vooramen ovale. PPHN beïnvloedt 2-6 per 1000 levendgeborenen en brengt een 8-10% risico op sterfte en aanzienlijke korte termijn en lange termijn morbiditeit 2. Bovendien kunnen zeer laag geboortegewicht prematuren pulmonale hypertensie ontwikkelen als gevolg van de onderliggende longaandoening. De meest voorkomende onderliggende longaandoening bij prematuren is bronchopulmonale dysplasie (BPD). Terwijl het totale risico op BPD correleert met de zwangerschapsduur en geboortegewicht, blijft het onduidelijk waarom een subset van deze kinderen ontwikkelt significante pulmonale hypertensie en hoe adequaat te behandelen deze zuigelingen. Slechte resultaten, met inbegrip van langdurige ziekenhuis verblijven en verhoogde mortaliteit, komen vaak voor 3-6.
Historisch gezien hebben schapen foetale PASMC of varkens foetale PASMC van gezonde dieren die zijn gebruikt om de signaalwegen betrokken bij de normale longvaten overgang na de geboorte te bestuderen. Deze zijn meestal geïsoleerd van de vijfde generatie weerstand PA van eenn schapen of varkens foetus die wordt geleverd en gedood vóór elke spontane ademhaling 7-9. Daarnaast hebben sommige onderzoekers geïsoleerd en gebruikt PASMC van iets oudere en spontaan ademende lammeren en biggen op 3 dagen, 2 weken, en 4 weken 10-12. Meer recent, hebben sommige groepen met succes geïsoleerd en gebruikt PASMC geïsoleerd van lammeren met PPHN aan de derangements onderzoeken signaalwegen in de ziekte staat 13-17. Deze cellen hebben bewezen een waardevol instrument om te onderzoeken welke signaalwegen zijn cruciaal in zowel de normale en zieke op korte termijn en de termijn longvaatbed zijn. Echter, hebben ze geen inzicht geven in de signaalwegen beïnvloed bij prematuren met pulmonale hypertensie. Ook maken zij de mogelijkheden van genetische manipulatie gezien in muismodellen van ziekte.
Rat en muis modellen zijn al lange tijd gebruikt om het model BPD en meer recentelijk worden gebruikt om het model pulmonale hypertension gevolg van BPD 18-22. Neonatale ratten zijn verleidelijk om mee te werken als gevolg van hun grotere omvang, maar ze ook last hebben van een gebrek aan mogelijkheden voor genetische modificatie. Genetisch gemodificeerde dieren zijn uitgebreid gebruikt om de effecten van bepaalde gendoelstellingen in gehele dierlijke fysiologie bij neonatale muizen te onderzoeken, maar tot nu toe niemand eerder succesvol geïsoleerd PASMC Uit deze muizen. Door het isoleren PASMC kan meer informatie worden verkregen over routes veranderen als reactie op prikkels uit de omgeving en / of genetische modificatie specifiek in de longslagader gladde spieren. Daarnaast kan levend PASMC worden afgebeeld in real time om snelle veranderingen in belangrijke signaalmoleculen zoals calcium en zuurstofradicalen 23-25 te onderzoeken. We hebben onlangs beschreven succesvolle isolatie van PASMC van volwassen muizen met een variant van de techniek van Marshall et al.. 26 gebruikt voor het isoleren rat PASMC 23,25,26. We hebben nu een aangepastnd uitgebreid deze techniek om kleine muizen 7-21 dagen leeftijd (P7, P14 en P21). De belangrijkste beperking van deze nieuwe PASMC isolatietechniek is dat het meerdere muizen voldoende cellen voor experimenten genereren en dat de cellen groeien zeer langzaam, die kenmerkend primaire gladde spiercellen. Ondanks deze beperkingen, geloven wij deze techniek neonatale muis PASMC isolaat zal voor de versterkte onderzoek van de belangrijkste signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van longhypertensie en vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in dit gebied.
In dit manuscript beschrijven we voor het eerst de isolatie van PASMC van muizen op P7, P14 en P21. Om dit te bereiken, wordt een suspensie van agarose en 0,2 uM ijzerdeeltjes toegediend langs de RV in de PA. Vanwege de kleine omvang van de ijzerdeeltjes, kunnen ze niet door de pulmonale capillaire bed en zijn dus afgezet in de kleine PA. De longen worden opgeblazen, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden getrokken uit de oplossing met behulp van een magneet. Uiteindelijk worden de schepen uitgeplaat …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH HL109478 (KNF). De auteurs erkennen en dank Gina Kim en Joann Taylor voor hun hulp bij het isoleren en het handhaven van de PASMC in de cultuur.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |