בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים
Summary
פיתחנו רומן וטכניקה לשחזור לבודד את התרבויות העיקריות של תאי שריר חלק ריאתי עורקים (PASMC) מעכברים צעירים כP7 כ, ובכך לאפשר מחקר טוב יותר של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שרירים חלקה בילוד תא ורגיעה.
Abstract
יתר לחץ דם ריאה הוא גורם משמעותי לתחלואה ולתמותה בתינוקות. מבחינה היסטורית, יש כבר מחקר משמעותי של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שריר חלק בכלי הדם בPASMC מכבשים עוברי. בעוד כבשים להפוך מודל מצוין של יתר לחץ דם ריאת טווח, הם מאוד יקרים וחסרי התועלת של מניפולציה גנטית שנמצאה בעכברים. לעומת זאת, חוסר היכולת לבודד PASMC מעכברים הייתה מגבלה משמעותית של מערכת זו. כאן אנחנו יכולים לתאר את הבידוד של תרבויות העיקריות של העכבר PASMC מP7, P14, p21 ולעכברים באמצעות וריאציה של הטכניקה שתוארה לעיל של מרשל ואח'. -26 ששימש בעבר לבודד PASMC חולדה. PASMC העכברי אלה מייצגים כלי חדשני לחקר מסלולי איתות בתקופת הילוד. בקצרה, תרחיף של 0.5% (w / v) agarose + חלקיקי ברזל 0.5% בM199 תקשורת הוא החדיר לתוך מיטת כלי דם ריאתי דרך החדר ממני (RV).חלקיקי ברזל הם 0.2 מיקרומטר בקוטר ולא יכולים לעבור דרך מיטת נימי ריאה. לפיכך, לשכות הברזל בעורקי הריאה הקטנים (הרשות הפלסטינית). הריאות הן מנופחות עם agarose, הוסרה וניתקה. הכלים המכילים ברזל הם משכו למטה עם מגנט. לאחר collagenase (80 U / ml) טיפול וניתוק נוסף, כלי הם הכניסו לתוך צלחת תרבית רקמה בM199 מדיה המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS), ואנטיביוטיקה (M199 מדיה מלאה) כדי לאפשר נדידת תאים על גבי צלחת התרבות . צלחת ראשונית זה של תאים היא תערובת 50-50 של fibroblasts וPASMC. לפיכך, לניתץ הליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג אוכלוסיית PASMC טהורה יותר ולהסיר כל ברזל שיורית. זהות תא שריר החלק אושר על ידי immunostaining לחלקת שרירים שרירן וdesmin.
Introduction
יתר לחץ דם ריאתי הוא נורמלי במהלך חיים תוך רחמי מאז השליה משמשת כאיבר העיקרי של חילוף גזים ורק 10% מתפוקת הלב מופצים דרך מיטת כלי דם ריאתי. ברחם, לחצי ריאה דומים ללחצים מערכתיים בשל התנגדות כלי דם ריאתי גבוהה . עם התקדמות הריון, יש צמיחה מהירה של הרשות הפלסטינית הקטנה בתוך הריאות, מכינה את העובר לעלייה הדרמטית בזרימת דם ריאתי המתרחשת בלידה 1. כאשר מעבר הלידה הרגיל נכשל בתינוקות בטווח קרוב וטווח מלא, התוצאה היא יתר לחץ דם ריאה מתמשך של היילוד (PPHN). PPHN הוא תסמונת קלינית הנגרמת על ידי פתולוגיות בסיסיות רבות ושונות. עם זאת, כל התינוקות הללו חולקים תכונות משותפות pathophysiologic כגון עמידות גבוהה ריאות כלי דם, היפוקסמיה, והסטה מימין לשמאל של זרימת דם על פני חיבור קבוע בעובר כגון ductus arteriosus או עבוראמן ovale. PPHN משפיע 2-6 ל -1,000 לידה חיות ומעביר סיכון 8-10% מתמותה, כמו גם 2 תחלואה לטווח קצר וארוך טווח משמעותי. בנוסף, תינוקות במשקל לידה נמוכים מאוד מוקדמים עלולים לפתח יתר לחץ דם ריאתי כתוצאה ממחלת הריאות הבסיסית שלהם. מחלת הריאות הבסיסית הנפוצה ביותר של פגים היא דיספלזיה bronchopulmonary (BPD). אמנם את הסיכון הכולל של BPD בקורלציה עם גיל הריון ומשקל לידה, עדיין לא ברור למה משנה של תינוקות אלה מתפתח יתר לחץ דם ריאה משמעותי וכיצד לטפל כראוי תינוקות אלה. תוצאות עניות, כוללים נשאר בבית החולים ממושכים ותמותה מוגברת, נפוצות 3-6.
מבחינה היסטורית, PASMC עוברי כבש או PASMC העוברי חזירית מבעלי החיים בריאים כבר בשימוש כדי ללמוד את מסלולי האיתות מעורבים במעבר בכלי הדם הריאתיים הרגיל לאחר לידה. אלה בדרך כלל מבודדים מהרשות הפלסטינית התנגדות הדור החמישית שלn כבש או עובר חזירי שמועבר ומורדם לפני כל נשימה ספונטנית 7-9. בנוסף, חלק מהחוקרים הצליחו לבודד ומנוצלים מPASMC מעט מבוגר ונושמים באופן ספונטני כבשים וחזרזירים ב3 ימים, 2 שבועות, ו 4 שבועות 10-12. לאחרונה, חלק מהקבוצות יש לבודד בהצלחה ומנוצלות PASMC מבודד מכבשים עם PPHN לבחון את derangements במסלולי איתות במצב המחלה 13-17. תאים אלה הוכיחו להיות כלי רב ערך כדי לבחון איזה מסלולי איתות הם קריטיים הן בכלי דם ריאתי בטווח קרוב וטווח הבריאים והחולים. עם זאת, הם לא נותנים תובנה מסלולי האיתות המושפעים בפגים עם יתר לחץ דם ריאתי. הם גם אינם מאפשרים את האפשרויות של מניפולציה גנטית ראתה במודלי עכבר של מחלה.
מודלים חולדה ועכבר היו בשימוש זמן רב למודל BPD ולאחרונה נמצאים בשימוש כדי הי"ד ריאת מודלpertension כתוצאה מהפרעת האישיות גבולית 18-22. חולדות ילודים הם מפתים לעבוד עם בשל הגודל הגדול שלהם, אבל הם גם סובלים ממחסור בפוטנציאל לשינוי גנטי. בעלי חיים מהונדסים גנטי היו בשימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעות של מטרות גן ספציפיות על פיזיולוגיה של בעלי חיים שלמים בעכברי יילודים, אך עד היום אף אחד לא מבודד בעבר בהצלחה PASMC מעכברים הקטנים האלה. על ידי בידוד PASMC, ניתן לקבל מידע רב יותר על איך לשנות מסלולים בתגובה לגירויים ו / או שינוי גנטי ספציפי בשריר חלק עורק הריאה סביבתיים. בנוסף, ניתן הדמיה החי PASMC בזמן אמת כדי לבחון שינויים מהירים במולקולות איתות מפתח כגון סידן וחמצן מינים תגובתי 23-25. לאחרונה תאר את הבידוד המוצלח של PASMC מעכברים בוגרים באמצעות וריאציה של הטכניקה של מרשל ואח'. -26 משמשים כדי לבודד חולדת PASMC 23,25,26. עכשיו יש לנו מותאםND הוארך בטכניקה זו כדי עכברים קטנים 7-21 ימים של גיל (P7, P14, P21 ו). המגבלה העיקרית לטכניקה בידוד PASMC החדשה זו היא שהיא דורשת עכברים מרובים כדי לייצר תאים מספיקים לניסויים ושהתאים גדלים באיטיות רבה, שהוא אופייני לתאי שריר חלק עיקריים. למרות מגבלות אלה, אנו מאמינים בטכניקה זו כדי לבודד PASMC עכבר ילוד תאפשר לחקירה המשופרת של מסלולי איתות המרכזיים המעורבים בהתפתחות של יתר לחץ דם ריאתי ומייצגות התקדמות משמעותית בתחום זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים בפעם הראשונה את הבידוד של PASMC מעכברים בP7, P14, P21 ו. על מנת להשיג זאת, תרחיף של agarose ו -0.2 חלקיקי ברזל מיקרומטר הם חדורים דרך קרוואנים לרשות הפלסטינית. בשל גודלו הקטן של חלקיקי הברזל, הם לא יכולים לעבור דרך מיטת נימי ריאה ומופקדת ברשות הפלסטינית ובכך הק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL109478 (KNF). החוקרים מכירים בכך ומודים לג'ינה וג'ואן קים טיילור על עזרתם בבידוד ושמירת PASMC בתרבות.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
