신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리
Summary
우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.
Abstract
폐동맥 고혈압은 사망률과 유아 사망률의 중요한 원인이다. 역사적으로, 태아 양에서 PASMC 혈관 평활근 수축에 관여 신호 경로의 중요한 연구가 있었다. 양 기간 폐동맥 고혈압의 훌륭한 모델을 만드는 동안, 그들은 매우 고가이며 생쥐에서 발견 된 유전자 조작의 장점을 부족합니다. 반대로, 마우스에서 PASMC를 분리 할 수 없다는 그 시스템의 중요한 제한했다. 여기에서 우리는 마샬 등의 이전에 설명한 기법의 변형을 사용하여 P7, P14 및 P21 마우스에서 마우스 PASMC의 차 문화의 격리를 설명했다. 26 일 이전에 쥐 PASMC을 분리하는 데 사용합니다. 이 생쥐 PASMC은 신생아시기에 경로 신호의 연구를위한 새로운 도구를 나타냅니다. 간단히, 0.5 %의 슬러리 (W / V) 아가 + M199 미디어에서 0.5 % 철 입자가 우심실 (RV)을 통해 폐 혈관 침대로 주입된다.철 입자의 직경은 0.2 μM이며, 폐 모세 혈관을 통과 할 수 없습니다. 따라서, 작은 폐동맥 (PA)에있는 철 라지. 폐를 제거하고 해리 아가로 팽창하고 있습니다. 철 함유 혈관 자석으로 내려 오게된다. 콜라게나 제 (80 U / ㎖) 처리 및 추가로 분리 한 후, 혈관 배양 접시에 세포 이동을 허용하는 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제 (M199 완전한 미디어)를 포함 M199 미디어 조직 배양 접시에 넣고 . 세포의이 초기 판은 섬유 아세포와 PASMC의 비율로 혼합입니다. 따라서, 절차 풀다운는보다 순수 PASMC 인구를 달성하고 잔여 철분을 제거하기 위해 여러 번 반복됩니다. 평활근 세포의 ID는 평활근 마이 오신과 최근 desmin에 대한 면역 염색에 의해 확인된다.
Introduction
태반 가스 교환의 주요 기관의 역할과 심 박출량의 10 %가 폐 혈관 침대를 통해 순환하기 때문에 폐동맥 고혈압은 자궁 수명 기간 동안 정상입니다. 자궁, 폐 압력이 높은 폐 혈관 저항에 의한 전신 압력과 유사하다 . 임신이 진행되면서, 폐 내의 작은 PA의 급속한 성장은 출생 1에서 발생 폐 혈류의 극적인 증가를위한 태아 준비가있다. 일반 산기 전환이 가까운 기간 및 전체 기간 유아에 실패하면, 결과는 (PPHN) 신생아의 지속성 폐동맥 고혈압이다. PPHN는 다양한 기본 병리에 의한 임상 증후군이다. 그러나 이러한 유아의는 동맥관로 또는 영구적 태아의 연결을 통해 이러한 높은 폐 혈관 저항, 저산소증,과 혈액 흐름의 오른쪽에서 왼쪽으로 션트과 같은 일반적인 병태 생리 학적 기능을 공유의 ovale 아멘. PPHN은 1,000 명당 2-6에 영향을 미치는 사망률뿐만 아니라 상당한 단기 및 장기 사망률 2의 8-10 %의 위험을 전달합니다. 또한, 매우 낮은 출생 체중 미숙아는 기본 폐 질환의 결과로 폐동맥 고혈압을 개발할 수 있습니다. 미숙아의 가장 일반적인 기본 폐 질환은 기관지 이형성증 (BPD)입니다. BPD의 전반적인 위험은 재태 연령과 출생 체중과 관련이 있지만 이러한 유아의 집합 상당한 폐 고혈압과 방법을 적절하게 이러한 유아 치료 방법을 개발 이유는 확실하지 않다. 장기간의 입원 및 사망률 증가 등의 나쁜 결과는 3-6 일반적입니다.
역사적으로, 건강한 동물로부터 양의 태아 PASMC 또는 돼지 태아 PASMC는 출생 후 정상적인 폐 혈관 변화에 관련된 신호 전달 경로를 연구하는 데 사용되었습니다. 이들은 일반적으로 다섯 번째 세대 저항 PA에서 격리됩니다N 양의하거나 자발적 호흡 7-9 이전에 전달하고 안락사되는 돼지 태아. 또한, 일부 연구자들은 고립 된 약간 이상에서 PASMC 활용하고 자발적으로 1 일, 1 주, 4 주 10-12에서 양 및 돼지를 호흡했다. 최근에는 일부 그룹이 성공적으로 고립 질병 상태 13-17에서 경로 신호에 derangements를 검사 PPHN과 양에서 분리 PASMC을 활용했다. 이러한 세포는 신호 경로가 정상과 질병 단기 및 장기 폐 혈관 모두에서 중요하다 어떤 검사하는 유용한 도구가 될 입증했다. 그러나, 그들은 폐 고혈압 미숙아에 영향 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 또한 그들은 질병의 마우스 모델에서 본 유전자 조작의 가능성을 허용합니다.
쥐와 마우스 모델은 긴 모델 BPD에 사용되었습니다 그리고 더 최근의 모델 폐 HY에 사용되는BPD 18-22 인한 pertension. 신생아 쥐들은 더 큰 크기로 인해 작업을 유혹하는 있지만, 그들은 또한 유전자 변형에 대한 가능성의 부족으로 고통 받고 있습니다. 유전자 변형 동물은 광범위 신생아 생쥐에서 전체 동물 생리학의 특정 유전자 표적의 효과를 조사하기 위해,하지만 아무도 이전에 성공적으로이 작은 생쥐 PASMC 고립 없다 최신 사용되었습니다. PASMC을 분리하여, 더 많은 정보는 경로가 환경 자극 및 / 또는 폐동맥 평활근 구체적으로 유전자 조작에 대한 응답으로 변경하는 방법에 대해 얻을 수 있습니다. 또한, 라이브 PASMC는 칼슘과 반응 산소 종 23-25와 같은 핵심 신호 분자의 급속한 변화를 검사하는 실시간 군데 할 수 있습니다. 우리는 최근 마샬 등의 기술 변화를 사용하여 성인 마우스에서 PASMC의 성공적인 격리를 설명했다. 26 쥐에게 PASMC 23,25,26를 분리하는 데 사용됩니다. 우리는 지금을 적응ND는 7-21일 시대의 작은 쥐 (P7, P14 및 P21)에이 기술을 확장했다. 이 새로운 PASMC 분리 기술에 대한 기본 한계는 실험을위한 충분한 세포를 생성하기 위해 여러 쥐를 필요로하며, 세포가 기본 평활근 세포의 특징 인, 아주 천천히 성장하는 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리는 신생아 마우스 PASMC을 분리하는이 기술은 폐동맥 고혈압의 개발에 관여하고이 분야에서 상당한 진보를 대표하는 중요한 신호 전달 경로의 향상된 조사 할 것으로 판단된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서, 우리는 처음 P7, P14 및 P21에서 생쥐 PASMC의 분리에 대해 설명합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 아가와 0.2 μM 철 입자의 슬러리는 PA에 RV를 통해 주입된다. 철 입자의 작은 크기로 인해, 그들은 폐 모세 혈관을 통과 할 수 있으며, 따라서 작은 PA에 입금됩니다. 폐는 팽창 제거 해리된다. 철 함유 혈관 자석을 사용하여 솔루션을 떠나게된다. 궁극적으로, 혈관 조직 배양 접시에 도금하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH HL109478 (KNF)에 의해 지원되었다. 저자는 분리와 문화 PASMC을 유지 인정하고 그들의 도움을지나 김 조앤 테일러 감사합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
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