Um protocolo para a entrega intraductal não-invasivo de reagentes aquosas para a glândula mamaria do rato está descrito. O método aproveita injecção localizada nos mamilos das glândulas mamárias destinadas especificamente ductos mamários. Esta técnica é adaptável para uma variedade de compostos, incluindo o siRNA, agentes quimioterapêuticos e moléculas pequenas.
Aqui nós descrevemos um protocolo para entregar vários reagentes para a glândula mamária do mouse através de injeções intraductais. Entrega da droga localizada e knock-down de genes dentro do epitélio mamário tem sido difícil de alcançar devido à falta de moléculas alvo apropriadas que são independentes da fase de desenvolvimento, tais como a gravidez ea lactação. Descrevemos uma técnica para a distribuição localizada de reagentes para a glândula mamaria, em qualquer fase na idade adulta através de injecção intraductal nos bocais de ratinhos. As injecções podem ser realizadas em ratinhos vivos, sob anestesia, e permitem uma entrega não-invasivo e localizada de drogas para a glândula mamaria. Além disso, as injeções podem ser repetidas ao longo de vários meses, sem danificar o mamilo. Corantes vitais, tais como azul de Evans são muito úteis para aprender a técnica. Após a injecção intraductal do corante azul, todo o dutal torna-se visível a olho nu. Além disso, os reagentes de marcação fluorescente permitem tambémvisualização e distribuição no interior da glândula mamaria. Esta técnica é adaptável para uma variedade de compostos, incluindo o siRNA, agentes quimioterapêuticos, e pequenas moléculas.
A glândula mamaria do rato é composto por uma árvore ductal-alveolar complexo que converge para um tubo central, no mamilo. Em ratinhos, bem como os seres humanos, a maioria dos tumores da mama são originários das células epiteliais que revestem os ductos. Os tratamentos atuais disponíveis incluem quimioterapia intravenosa, radioterapia e cirurgia. Tratamentos intraductais localizadas foram exploradas 1-3 e oferecem vantagens significativas em termos de redução de toxicidade e contra. No entanto, vários desafios permanecem antes que estes podem ser aplicados de forma mais ampla. A capacidade de executar procedimentos comparáveis na glândula mamária do mouse facilita a caracterização de intervenções intraductais. Aqui apresentamos um método não-invasivo para a entrega de reagentes diretamente no duto mamário mouse.
Entrega Intraductal de agentes quimioterápicos em ambos os pacientes com câncer de mama e modelos de mouse tem sido mostrado previamente para ser altamente eficaz, sem evidência detoxicidade sistêmica ou histopatológico de longo prazo muda 3-6. Além disso, a injecção de células tumorais e de distribuição de vectores lentivirais de oncogenes têm sido mostrado previamente para ser possível por meio de injecção intraductal 7-10.
Em adição à entrega da droga, este processo é útil para o silenciamento de genes locais de glândulas mamárias através de injecção intraductal de siRNA. A injeção de pequenos volumes de solução de siRNA é eficaz, sem alterar a anatomia e fisiologia da glândula mamária. No nosso laboratório mostraram recentemente o silenciamento dos genes bem sucedida mediador chave em ratinhos transgénicos que desenvolvem espontaneamente tumores mamários, resultando na prevenção da progressão do tumor (Brock et al., Não publicado). Fomos capazes de repetir injecções quinzenais para os mesmos bocais até sete vezes em intervalos de 2 semanas, com nenhum dano no tecido visível ou toxicidade.
Injeções intraductais pode ser cronometrada em um rato adulto para lidar com desenvolvimentoeventos opmentally específicas relevantes para o desenvolvimento da glândula mamária durante a gestação, lactação e involução ou para atingir estágios mais avançados durante o desenvolvimento e progressão tumoral. Fêmeas virgens tão jovens quanto 8 semanas de idade foram injetados não-invasiva em nosso laboratório.
Transgênicos e knockout camundongos são ferramentas inestimáveis para estudar o papel in vivo de genes individuais em câncer de mama. No entanto, isso é caro e para gerar estes animais demorado e o knockdown do gene é normalmente ubíquo que, por vezes, nos impede de reconhecer os efeitos específicos de gene em que a glândula mamaria. Portanto, um knockdown alvo seria aliviar problemas de efeitos colaterais não-específicos e toxicidades em outros órgãos.
A injecção intraductal de siRNA aqui apresentada permite o knockdown gene localizado na glândula mamária do rato. É um método rápido para a entrega de drogas específicas e localizada para a glândula mamaria não se limitando a entrega de siRNA. Tal entrega mamária fármaco específico da glândula evita os efeitos secundários e toxicidade não específicos para outros órgãos e permite o estudo de alterações do gene em pontos de tempo específicos durante o desenvolvimento da glândula mamaria e a formação do tumor da mama. Não há nenhuma evidência de SiPartículas de RNA em glândulas não injectados, o fígado ou outros órgãos que fornecem evidências adicionais de que este método apresenta um modo preferido para knockdown gene localizado na glândula mamária. Além disso, as injecções intraductais pode ser repetido semanalmente ou quinzenalmente ao longo de vários meses, para permitir a monitorização de longo prazo de agentes terapêuticos.
Esta técnica abre-se a possibilidade de ensaiar a entrega intraductal de vários reagentes para os ductos mamários de ratinho. Avanços na entrega localizada em modelos bem caracterizados rato deve acelerar a aplicação do não-invasiva, alvo estratégias terapêuticas em seres humanos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Michael Goldberg para preparar solução siRNA estabilizado e Heather Tobin por sua assistência com os animais. Este estudo foi financiado pelo Departamento de Defesa Innovator Award W81XWH-08-1-0659 para DEI. O treinamento de pós-doutorado de SK foi apoiado pela fundação Susan G Komen (KG101329). Os autores gostariam de agradecer a Kristin Johnson para a preparação do esquema.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |