Un protocollo per la consegna intraduttale non invasiva di reagenti acquosi alla ghiandola mammaria topo è descritto. Il metodo si avvale di iniezione localizzato nei capezzoli delle ghiandole mammarie destinati dotti mammari in particolare. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici e piccole molecole.
Qui descriviamo un protocollo per consegnare vari reagenti al mouse ghiandola mammaria tramite iniezioni intraduttali. Consegna della droga localizzata e knock-down di geni all'interno dell'epitelio mammario è stato difficile da raggiungere a causa della mancanza di adeguati molecole di targeting che sono indipendenti di stadi di sviluppo come la gravidanza e l'allattamento. Qui, descriviamo una tecnica per la consegna localizzata dei reagenti alla ghiandola mammaria in qualsiasi fase adulta mediante iniezione intraduttale nei capezzoli di topi. Le iniezioni possono essere eseguite su topi vivi, sotto anestesia, e consentono una consegna non invasiva e localizzata farmaco alla ghiandola mammaria. Inoltre, le iniezioni possono essere ripetute per diversi mesi senza danneggiare il capezzolo. Coloranti vitali come il Blu di Evans sono molto utili per imparare la tecnica. Una volta iniettato intraduttale del colorante blu, l'intero albero duttale diventa visibile all'occhio. Inoltre, reagenti fluorescente consentono anchevisualizzazione e distribuzione all'interno della ghiandola mammaria. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici, e piccole molecole.
La ghiandola mammaria mouse è composto da un albero duttale-alveolare complesso che converge in un condotto centrale al capezzolo. Nei topi che nell'uomo, la maggior parte dei tumori al seno hanno origine nelle cellule epiteliali che rivestono i dotti galattofori. Trattamenti attualmente disponibili comprendono la chemioterapia endovenosa, radioterapia e chirurgia. Intraduttali trattamenti localizzati sono state esplorate 1-3 e offrono vantaggi significativi in termini di tossicità ed effetti collaterali ridotti. Tuttavia, molte sfide restano prima che queste possano essere applicate più ampiamente. La possibilità di eseguire procedure comparabili nella ghiandola mammaria topo facilita la caratterizzazione degli interventi intraduttale. Presentiamo qui un metodo non invasivo per la fornitura di reagenti direttamente nel condotto mammaria mouse.
Consegna intraduttale di agenti chemioterapici in entrambe le pazienti con carcinoma mammario e modelli di topo è stato precedentemente dimostrato di essere altamente efficace senza evidenza ditossicità sistemica o istopatologico cambiamenti a lungo termine 3-6. Inoltre, l'iniezione di cellule tumorali e consegna vettore lentivirale di oncogeni hanno dimostrato in precedenza di essere realizzabile tramite iniezione intraduttale 7-10.
Oltre alla somministrazione di farmaci, questa procedura è utile per silenziamento locale di geni della ghiandola mammaria mediante iniezione intraduttale di siRNA. L'iniezione di piccoli volumi di soluzione siRNA è efficace senza alterare l'anatomia e la fisiologia della ghiandola mammaria. Nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato con successo il silenziamento di geni mediatore chiave in topi transgenici che sviluppano spontaneamente tumori mammari con conseguente prevenzione della progressione tumorale (Brock et al., Inedito). Siamo stati in grado di ripetere le iniezioni bisettimanali negli stessi capezzoli fino a 7 volte a intervalli di 2 settimane, senza danni ai tessuti visibili o tossicità.
Iniezioni intraduttali possono essere a tempo in un topo adulto per affrontare develeventi opmentally specifici rilevanti per lo sviluppo della ghiandola mammaria durante la gravidanza, l'allattamento, e involuzione o di indirizzare fasi successive durante lo sviluppo e progressione tumorale. Femmine vergini giovani come 8 settimane di età sono state iniettate in modo non invasivo nel nostro laboratorio.
Transgenici e topi knockout sono strumenti preziosi per studiare il ruolo in vivo dei singoli geni nel cancro al seno. Tuttavia, è costoso e di generare questi animali richiede tempo e knockdown gene è solitamente onnipresente che a volte ci impedisce di riconoscere gli effetti specifici di tale gene sulla ghiandola mammaria. Pertanto, un atterramento mirata allevierebbe questioni di non-specifici effetti collaterali e tossicità in altri organi.
L'iniezione intraduttale di siRNA qui presentata consente knockdown gene localizzato nella ghiandola mammaria mouse. Si tratta di un metodo rapido per una somministrazione di farmaci mirati e localizzato alla ghiandola mammaria non limitato alla consegna siRNA. Tale somministrazione di farmaci specifici ghiandola mammaria evita aspecifiche effetti collaterali e la tossicità verso altri organi e consente lo studio di alterazioni geniche in punti temporali specifici durante lo sviluppo della ghiandola mammaria e formazione del tumore al seno. Non c'è evidenza di SiParticelle di RNA in ghiandole non iniettati, fegato o di altri organi che forniscono ulteriore prova che questo metodo presenta un modo preferito per knockdown gene localizzato nella ghiandola mammaria. Inoltre, le iniezioni possono essere ripetute intraduttale settimanale o bisettimanale diversi mesi per permettere il monitoraggio a lungo termine degli agenti terapeutici.
Questa tecnica apre la possibilità per saggiare la consegna intraduttale di vari reagenti ai dotti mammari del mouse. Advances in erogazione localizzata in modelli murini ben caratterizzati dovrebbero accelerare l'applicazione di non invasiva, mirate strategie terapeutiche nell'uomo.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Michael Goldberg per la preparazione della soluzione siRNA stabilizzato e Heather Tobin per la sua assistenza con gli animali. Questo studio è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa Innovator Award W81XWH-08-1-0659 al DEI. La formazione post-dottorato di SK è stato sostenuto dalla Fondazione Susan G Komen (KG101329). Gli autori desiderano ringraziare Kristin Johnson per la preparazione dello schema.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |