פרוטוקול למשלוח intraductal לא פולשנית של חומרים כימיים מימיים לבלוטת החלב בעכבר מתואר. השיטה מנצלת הזרקה מקומית לפטמות של בלוטות החלב מיקוד צינוריות החלב באופן ספציפי. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות ומולקולות קטנות.
במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול, כדי לספק חומרים כימיים שונים לבלוטת החלב בעכבר באמצעות זריקות intraductal. משלוח סמים מקומי ולדפוק למטה של גנים באפיתל החלב כבר קשה להשיג בשל חוסר מיקוד המולקולות מתאימות שאינן תלויים בשלבי התפתחות, כמו הריון והנקה. בזאת, אנו מתארים טכניקה למסירה מקומית של חומרים כימיים לבלוטת החלב בכל שלב בבגרות באמצעות הזרקת intraductal לפטמות של עכברים. ניתן לבצע הזריקות בעכברים חיים, תחת הרדמה, ולאפשר אספקת סמים לא פולשנית ומקומית לבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על הזריקות במשך כמה חודשים מבלי לפגוע בפטמה. צבעים חיוניים כגון אוונס הכחול מועילים מאוד ללמוד את הטכניקה. על זריקת intraductal של הצבע הכחול, עץ ductal כל הופך לגלוי לעין. יתר על כן, חומרים כימיים שכותרתו fluorescently גם לאפשרהדמיה והפצה בתוך בלוטת החלב. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות, ומולקולות קטנות.
בלוטת החלב בעכבר מורכבת מעץ ductal-מכתשיים מורכבים המתכנס לתוך צינור מרכזי בפטמה. בעכברים, כמו גם בני אדם, רוב הגידולים בשד מקורם בתאי האפיתל המצפים את צינוריות החלב. טיפולים זמינים הנוכחיים כוללים כימותרפיה לוריד, קרינה, וניתוח. טיפולי intraductal מקומיים נחקרו 1-3 ומציעים יתרונות משמעותיים במונחים של השפעות רעילות וצד מופחתים. עם זאת, כמה אתגרים להישאר לפני אלה יכולים להיות מיושמים באופן נרחב יותר. היכולת לבצע הליכים דומים בבלוטת החלב בעכבר מאפשרת האפיון של התערבויות intraductal. כאן אנו מציגים שיטה לא פולשנית למשלוח של חומרים כימיים ישירות לתוך צינור החלב העכבר.
משלוח intraductal של תרופות כימותרפיות בשתי חולות סרטן השד ומודלי עכבר יש בעבר הוכח כיעיל ביותר ללא עדותרעילות מערכתית או histopathological לטווח ארוך משתנה 3-6. יתר על כן, הזרקה של תאי גידול ואספקת וקטור lentiviral של אונקוגנים הוכחו בעבר להיות ריאלי באמצעות הזרקת intraductal 7-10.
בנוסף למשלוח סמים, הליך זה הוא שימושי להשתקה מקומית של גנים בלוטת החלב באמצעות הזרקת intraductal של siRNA. הזרקה של כמויות קטנות של פתרון siRNA היא יעילה מבלי לשנות את האנטומיה ופיזיולוגיה של בלוטת החלב. במעבדה שלנו יש לנו לאחרונה הראו השתקה מוצלחת של גנים מתווך מרכזיים בעכברים הטרנסגניים כי באופן ספונטני לפתח גידולי החלב וכתוצאה מכך מניעת התקדמות גידול (ברוק ואח'., לא פורסם). אנחנו כבר מסוגלים לחזור על זריקות דו שבועיות לאותו פטמות עד 7 פעמים במרווחים של 2 שבועות ללא נזק לרקמות גלויות או רעיל.
יכולות להיות מתוזמן זריקות intraductal בעכבר בוגר כדי לטפל בdevelאירועי opmentally ספציפיים רלוונטיים להתפתחות בלוטת החלב במהלך הריון, הנקה, ופוף או למקד שלבים מאוחר יותר במהלך התפתחות גידול והתקדמות. נקבות בתולה צעירות כמו 8 שבועות של גיל כבר הזריקו הלא פולשני במעבדה שלנו.
עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט הם כלים רב ערך ללימוד תפקיד vivo של גנים בודדים בסרטן השד. עם זאת, זה יקר וכדי לייצר בעלי חיים אלה גוזלים זמן ומציאת הגן היא בדרך כלל בכל מקום שלעתים מונע אותנו מההכרה בהשפעות הספציפיות של גן, כי בבלוטת החלב. לכן, מציאה ממוקדת הייתי להקל על בעיות של תופעות לוואי שאינם ספציפיות ורעילות באיברים אחרים.
הזרקת intraductal של siRNA מוצגת כאן מאפשרת מציאה הגן המקומית בבלוטת החלב בעכבר. זוהי שיטה מהירה למשלוח תרופות ממוקדת ומקומי לבלוטת החלב אינו מוגבלת למשלוח siRNA. כגון משלוח סמים בלוטה ספציפית החלב ימנע תופעות לוואי נוקבות ורעיל לאיברים אחרים ומאפשר לחקר שינויים גנטיים בנקודות זמן ספציפיות במהלך התפתחות בלוטת החלב והיווצרות גידול סרטנית בשד. אין עדות לסיחלקיקי RNA בבלוטות שאינן מוזרקות, בכבד או באיברים אחרים המספקים ראיות נוספות לכך ששיטה זו מציגה דרך מועדפת למציאת גן מקומית בבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על זריקות intraductal שבועיות או דו שבועית במשך כמה חודשים, כדי לאפשר לניטור ארוך טווח של סוכנים טיפוליים.
טכניקה זו פותחת את האפשרות למנסה לאמוד את מסירת intraductal של חומרים כימיים שונים לצינוריות החלב בעכבר. התקדמות במשלוח מקומי במודלי עכבר מאופיינים היטב צריכה להאיץ את היישום של לא פולשנית, ממוקד אסטרטגיות טיפוליות בבני אדם.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות למייקל גולדברג להכנת פתרון siRNA התייצב והת'ר טובין לעזרתה עם בעלי החיים. מחקר זה מומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי פרס ממציא W81XWH-08-1-0,659 לDEI. הכשרת דוקטורט של SK נתמכה על ידי קרן סוזן G קומן (KG101329). המחברים מבקשים להודות לקריסטין ג'ונסון להכנת סכמטי.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |