Summary

Growth La medición y de la Expresión Génica Dinámica de Tumor-Targeted<em> S. Typhimurium</em> Las bacterias

Published: July 06, 2013
doi:

Summary

La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada<em> S. typhimurium</em> Colonias de bacterias que crecen dentro de tumores. Este video cubre la preparación tumor de células de y el implante de, la preparación bacteria y la inyección, proyección de imagen su conjunto-animal de luminiscencia, la excisión tumor, y el conteo de colonia bacteriana.

Abstract

La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada S. typhimurium colonias bacterianas que crecen dentro de los tumores.

Hemos generado los tumores de xenoinjerto modelo en ratones mediante inyección subcutánea de una línea celular de cáncer de ovario humana, OVCAR-8 (NCI Repositorio de Tumor DCTD, Frederick, MD).

Se transformaron cepas atenuadas de S. bacterias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasa expresada constitutivamente (luxCDABE) plásmido para la visualización 2. Estas cepas colonizan específicamente los tumores mientras que restante esencialmente no-virulenta a la del ratón 1.

Una vez que se establecieron los tumores medibles, las bacterias fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con diferentes dosis. Del Tumor-localizada, la expresión de genes bacteriana se monitorizó en el tiempo real a través de el curso de 60 horas utilizando unen sistema de imágenes in vivo (de IVIS). En cada punto de tiempo, los tumores se extirparon, se homogeneizó, y se sembraron para cuantificar las colonias bacterianas para la correlación con datos de expresión génica.

Juntos, este de datos rinde un medida cuantitativa de la en crecimiento in vivo y dinámica de la expresión de genes de las bacterias que crecen dentro de los tumores.

Introduction

La biología sintética ha progresado rápidamente en la última década y ahora está posicionada para impactar los problemas importantes de la energía y la salud. Sin embargo, expansión en el arena clínica ha sido ralentizado por las preocupaciones de seguridad y una ausencia de el desarrollo de criterios de diseño para en los circuitos de genéticos in vivo. Acelerar las aplicaciones médicas de alto impacto requerirá métodos que interactúan directamente con la infraestructura médica, circuitos genéticos que funcionan fuera del entorno de laboratorio controlado, y los huéspedes microbianos seguros y clínicamente aceptado utilizar.

Un número de cepas han sido investigado para la terapia de cáncer de debido a la su capacidad para crecer preferencialmente en los tumores de. Estos han incluido C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, y la S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generado particular, interés, ya que han exhibido la seguridad y la tolerancia en un número de los ensayos clínicos humanos 9-12. Estos bacteri un fueron mostrados inicialmente para crear efectos anti-tumorales a través de la estimulación de la sistema de inmune del huésped y por el agotamiento de nutrientes requeridos para el metabolismo de celular de cáncer de. De Producción de de carga terapéutica más tarde se añadió a través de modificaciones genéticos. Mientras que estos estudios representan importantes avances en el uso de las bacterias para las terapias de tumorales, la mayoría de los esfuerzos de existentes se han basado en de alta-nivel de expresión que típicamente da como resultado en la entrega de de alta dosificaciones, efectos de fuera de objetivo, y de desarrollo de la resistencia del huésped 13-16 de .

Ahora, la biología sintético puede añadir producción de de carga programable de mediante la utilización de circuitos de genéticos computacionalmente-diseñados que pueden realizar sensing y la entrega 17-20 avanzados. Estos circuitos de pueden ser diseñados para actuar como los sistemas de de entrega que detectan estímulos del tumor-específicas y de la libre-regular la de producción de carga como sea necesario. Sin embargo, el estudio de la función de estos circuitos en vivo hasta el momento ha sido difícil.

ve_content "> Dado que plásmidos son la marco común para los circuitos de sintéticos, nos describimos un método para caracterizar la dinámica de la la expresión de genes plásmido-basado en en in vivo el uso de un modelo de ratón. Estos métodos utilizan proyección de imagen luminiscencia de lapso de tiempo y la medición cuantitativa de la biodistribución. Juntos, estos enfoques proporcionan un marco para el estudio de redes de plásmido-basados ​​en in vivo para las aplicaciones clínicas.

Protocol

1. Preparación de células Líneas de células Passage que utilizan técnicas de cultivo celular estándar. En este experimento, se utilizaron células OVCAR-8 (NCI Repositorio tumor DCTD, Frederick, MD). Se cultivan las células a un objetivo confluencia del 80 – 100%. Se incuban las células con 5 ml de tripsina durante 5 min, a continuación, añadir 5 ml de medio RPMI + FBS para inactivar la tripsina. Harvest y el recuento de las células sobre un hemocitómetro. Volver a suspender en…

Representative Results

El uso de este protocolo, que son capaces de generar datos sobre el crecimiento in vivo y la dinámica de la expresión de genes de bacterias específicas del tumor. El flujo de trabajo general se resume en la Figura 1. En la primera etapa de, nos inyectamos bacterias (verde) y de la imagen el animal el uso de de IVIS para medir la expresión gen con luminiscencia (azul) como un reportero. Luego, en la segunda etapa, que los imp…

Discussion

El uso de este procedimiento, que son capaces de generar cursos a tiempo para el crecimiento y la dinámica de la expresión de genes de bacterias que colonizan los tumores. Si bien estas mediciones se realizan rutinariamente in vitro en cultivo discontinuo o dispositivos de microfluidos, que son mucho más difíciles de realizar in vivo.

Hay varias modificaciones que se pueden aplicar a estos métodos. Mientras que se utilizó la línea celular OVCAR-8 para generar nuestro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a H. Fleming para la lectura crítica y la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral Misrock (TD) y NDSEG de Becas de Postgrado (AP). SNB es un investigador del HHMI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

References

  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

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Cite This Article
Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

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