Summary

Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte<em> S. Typhimurium</em> Bacteriën

Published: July 06, 2013
doi:

Summary

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte genereren<em> S. typhimurium</em> Bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. Deze video behandelt tumorcel voorbereiding en de inplanting, bacteriën voorbereiding en injectie, hele-dier luminescentie beeldvorming, tumorexcisie, en bacteriële kolonie tellen.

Abstract

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte S. genereren typhimurium bacteriële kolonies groeien binnen tumoren.

We gegenereerde model xenograft tumoren bij muizen door subcutane injectie van een mens eierstokkanker cellijn, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

We getransformeerde verzwakte stammen van S. typhimurium bacteriën (ELH430: SL1344 PhoPQ-1) met een constitutief tot expressie luciferase (luxCDABE) plasmide voor visualisatie 2. Deze stammen specifiek koloniseren tumoren terwijl hoofdzaak niet-virulent blijven de muis 1.

Zodra meetbare tumoren werden vastgesteld, werden bacteriën intraveneus geïnjecteerd via de staartader met wisselende dosering. Tumor-gelokaliseerde werd bacteriële genexpressie in real tijd in de loop van 60 uur met eenin vivo imaging-systeem (IVIS). Op elk tijdspunt werden tumoren uitgesneden, gehomogeniseerd en uitgeplaat op bacteriële kolonies correlatie met genexpressiedata kwantificeren.

Tezamen zijn deze gegevens levert een kwantitatieve maat van de in vivo expressie en gen dynamiek van bacteriën groeien binnen tumoren.

Introduction

Synthetische biologie is veel vooruitgang geboekt de afgelopen tien jaar en is nu gepositioneerd om belangrijke problemen in de energie en gezondheid beïnvloeden. Echter, heeft uitbreiding in de klinische arena is vertraagd door bezorgdheid over de veiligheid en de afwezigheid van het ontwikkelen van ontwerpcriteria voor in vivo genetische circuits. Versnellen hoge impact medische toepassingen vereisen het gebruik van methoden die rechtstreeks interface met medische infrastructuur, genetische circuits die buiten het gecontroleerde laboratorium omgeving functioneren, en veilig en klinisch-aanvaarde microbiële gastheren.

Een aantal stammen werden onderzocht voor de behandeling van kanker vanwege hun vermogen om bij voorkeur groeien in tumoren. Deze zijn opgenomen C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum en S. typhimurium 3-8. S. typhimurium heeft bijzondere belangstelling opgewekt als ze de veiligheid en tolerantie zijn tentoongesteld in een aantal menselijke klinische proeven 9-12. Deze bacteri een aanvankelijk aangetoond dat anti-tumor effecten via stimulatie van het gastheerimmuunsysteem en uitputting van voedingsstoffen die voor kanker celstofwisseling. Productie van therapeutische lading werd later toegevoegd door genetische modificaties. Hoewel deze studies vormen belangrijke vooruitgang in het gebruik van bacteriën voor tumor therapie, hebben de meerderheid van de bestaande inspanningen zich op hoog niveau expressie die doorgaans resulteert in de levering van hoge doseringen, off-target effecten, en de ontwikkeling van resistentie tegen 13-16 .

Nu, kan synthetische biologie programmeerbare lading productie toevoegen door gebruik te maken van computer-ontworpen genetische circuits die geavanceerde detectie en levering 17-20 kan uitvoeren. Deze circuits worden ontworpen als systemen die tumor-specifieke stimuli en zelfregulering cargo productie nodig zin. Echter, het bestuderen van de functie van deze schakelingen in vivo tot nu toe uitdagend.

ve_content "> Aangezien plasmiden zijn gemeenschappelijk kader voor synthetische circuits beschrijven we een methode om de dynamiek van plasmide-gebaseerde genexpressie karakteriseren in vivo in een muismodel. Deze werkwijzen maken gebruik van time-lapse luminescentie beeldvorming en kwantitatieve meting van biodistributie. Samen deze benaderingen een kader voor het bestuderen plasmide-gebaseerde netwerken in vivo klinische toepassingen.

Protocol

1. Cell Preparation Passage cellijnen met behulp van standaard celkweek technieken. In dit experiment gebruikten we OVCAR-8 cellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Kweek cellen een doel confluentie van 80-100%. Incubeer cellen met 5 ml trypsine gedurende 5 min, voeg 5 ml RPMI medium + FBS om trypsine te inactiveren. Oogst en tellen cellen op een hemocytometer. Resuspendeer in fenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 x 10 7 cellen / ml, of ongeveer 200 ul per…

Representative Results

Met behulp van dit protocol, zijn we in staat om gegevens over de in vivo groei en gen dynamiek expressie van tumor gerichte bacteriën genereren. De algehele werkstroom wordt samengevat in figuur 1. In de eerste fase, het injecteren we bacteriën (groen) en het dier met behulp van IVIS om genexpressie te meten met luminescentie (blauw) als verslaggever. Daarna, in de tweede fase, we accijnzen, homogeniseren, en plaat tumoren voor koloni…

Discussion

Met behulp van deze procedure, zijn we in staat om de tijd cursussen voor de groei en gen dynamiek expressie van bacteriën koloniseren tumoren te genereren. Hoewel deze metingen worden routinematig uitgevoerd in vitro in batch cultuur of microfluïdische apparaten, ze veel moeilijker uit te voeren in vivo.

Er zijn verscheidene modificaties kunnen worden toegepast op deze methoden. Terwijl we de OVCAR-8 cellijn onze muismodellen genereren, kan een aantal andere cellijnen ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken H. Fleming voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Misrock Postdoctoraal fellowship (TD) en NDSEG graduate fellowship (AP). SNB is een HHMI onderzoeker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

References

  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Play Video

Cite This Article
Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

View Video