Summary

قياس النمو وحيوية التعبير الجيني للورم استهداف<em> S. تيفوميوريم</em> البكتيريا

Published: July 06, 2013
doi:

Summary

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن<em> S. تيفوميوريم</em> المستعمرات البكتيرية المتزايد داخل الأورام. يغطي هذا الفيديو إعداد ورم الخلايا وزرع، وإعداد البكتيريا وحقن، والتصوير كله والحيوان التلألؤ، والاستئصال الورم، والبكتيرية العد مستعمرة.

Abstract

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن S. المستعمرات البكتيرية تيفوميوريم المتزايد داخل الأورام.

نحن ولدت الأورام طعم أجنبي نموذج في الفئران عن طريق الحقن تحت الجلد من المبيض خط الخلايا السرطانية البشرية، OVCAR-8 (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD).

نحن تحولت سلالات موهنة من S. البكتيريا التيفية الفأرية (ELH430: SL1344 phoPQ-1) مع وسيفيراز أعرب جوهري (luxCDABE) البلازميد عن التصور 2. هذه السلالات استعمار تحديدا أورام في حين تبقى أساسا غير خبيثة إلى الماوس 1.

مرة واحدة تم تأسيسها الأورام قابلة للقياس، تم حقن البكتيريا عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل مع اختلاف الجرعة. الورم المترجمة، تم رصد بكتيريا التعبير الجيني في الوقت الحقيقي على مدار 60 ساعة باستخدامفي الجسم الحي نظام التصوير (IVIS). في كل نقطة زمنية، ويستأصل الأورام، المتجانس، ومطلي ل quantitate المستعمرات البكتيرية للارتباط مع بيانات التعبير الجيني.

معا، هذه البيانات تعطي مقياس كمي للنمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا المتزايد داخل الأورام.

Introduction

وقد أحرز تقدم في البيولوجيا التركيبية بسرعة على مدى العقد الماضي، ويتم وضع الآن أن تؤثر المشاكل الهامة في مجال الطاقة والصحة. ومع ذلك، فقد تباطأ التوسع في الساحة السريرية من قبل مخاوف تتعلق بالسلامة وغياب وضع معايير لتصميم الدوائر الجينية في الجسم الحي. سوف تسريع التطبيقات الطبية عالية تأثير تتطلب استخدام أساليب تلك الواجهة مباشرة مع البنية التحتية الطبية، والدوائر الجينية التي تعمل خارج من إعداد مختبر للرقابة، والمضيفين الميكروبية آمنة وسريريا المقبولة.

وقد تم التحقيق في عدد من سلالات لعلاج السرطان نظرا لقدرتها على النمو بشكل تفضيلي في الأورام. وقد شملت هذه C. النوفية، كولاي، V. cholorae، B. الطويل ل، و س. تيفوميوريم 3-8. S. وقد ولدت تيفوميوريم أهمية خاصة لأنها أظهرت سلامة والتسامح في عدد من التجارب السريرية البشرية 9-12. هذه البكتريا عرضت في البداية لخلق تأثيرات مضادة للورم من خلال تحفيز الجهاز المناعي المضيف ونضوب المغذيات اللازمة لعملية التمثيل الغذائي الخلايا السرطانية. تم ادراج إنتاج البضائع العلاجية في وقت لاحق من خلال التعديلات الجينية. في حين أن هذه الدراسات تمثل تقدما هاما في استخدام البكتيريا لعلاجات الأورام، وقد اعتمدت غالبية الجهود القائمة على التعبير عن المستوى الذي ينتج عادة في إيصال جرعات عالية، والآثار بعيدا عن الهدف، وتطوير المقاومة المضيفة 13-16 .

الآن، قد البيولوجيا التركيبية إضافة إنتاج البضائع القابلة للبرمجة من خلال الاستفادة من الدوائر الجينية حسابيا التصميم التي يمكن أن تؤدي الاستشعار المتقدمة والتسليم 17-20. ويمكن تصميم هذه الدوائر لتكون بمثابة أنظمة التسليم التي تستشعر المحفزات ورم محددة والتنظيم الذاتي إنتاج البضائع حسب الضرورة. ومع ذلك، ودراسة وظيفة من هذه الدوائر في الجسم الحي وهكذا تم حتى الآن تحديا.

ve_content "> منذ البلازميدات هي إطار مشترك للدوائر الاصطناعية، ونحن تصف طريقة لوصف ديناميات التعبير الجيني القائم على البلازميد في الجسم الحي باستخدام نموذج الفأر. هذه الأساليب الاستفادة من الوقت الفاصل بين التصوير التلألؤ والقياس الكمي للbiodistribution. معا، توفر هذه النهج إطارا لدراسة الشبكات القائمة على البلازميد في الجسم الحي بالنسبة إلى التطبيقات السريرية.

Protocol

1. إعداد الخلية خطوط الخلايا مرور باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. في هذه التجربة، كنا OVCAR-8 خلايا (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD). تنمو الخلايا إلى confluency الهدف من 80-100٪. احتضان الخلايا مع …

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون على توليد بيانات عن النمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني للورم البكتيريا المستهدفة. ويلخص سير العمل الكلي في الشكل 1. في المرحلة الأولى، ونحن حقن البكتيريا (الخضراء) وص…

Discussion

باستخدام هذا الإجراء، ونحن قادرون على توليد الدورات الوقت لنمو وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا استعمار الأورام. في حين أن هذه القياسات تتم بصورة روتينية في المختبر في الثقافة دفعي أو الأجهزة على microfluidics، فهي لأداء في الجسم الحي أكثر صعوبة بكثير.

<p c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر H. فليمينغ لقراءة نقدية وتحرير للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل Misrock ما بعد الدكتوراه زمالة (TD) وNDSEG زمالة دراسات عليا (AP). البنك المركزي السويسري هو محقق HHMI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

References

  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Play Video

Cite This Article
Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

View Video