Summary

Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted<em> S. Typhimurium</em> Bakterien

Published: July 06, 2013
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Summary

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt erzeugen<em> S. typhimurium</em> Wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren. In diesem Video werden Tumorzelle Vorbereitung und Implantation Bakterien Vorbereitung und Injektion, Ganzkörper-Tier Lumineszenz Imaging, Tumorentfernung und bakterielle Koloniezahlbestimmung.

Abstract

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt S. generieren typhimurium wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren.

Wir generierte Modell Xenograft Tumoren in Mäusen durch subkutane Injektion eines menschlichen Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Wir verwandelt abgeschwächte Stämme von S. typhimurium Bakterien (ELH430: SL1344 phoPQ-1) mit einem konstitutiv exprimierten Luciferase (luxCDABE) Plasmid zur Visualisierung 2. Diese Stämme besiedeln speziell Tumoren während verbleibenden wesentlichen nicht-virulenten der Maus 1.

Sobald messbare Tumore wurden hergestellt wurden Bakterien intravenös über die Schwanzvene mit unterschiedlicher Dosierung injiziert. Tumor-lokalisiert wurde bakterielle Genexpression in Echtzeit im Laufe von 60 Stunden unter Verwendung eines überwachtenin vivo Imaging System (IVIS). Zu jedem Zeitpunkt wurden Tumore herausgeschnitten, homogenisiert und ausplattiert, um Bakterienkolonien Korrelation mit Genexpressionsdaten quantifizieren.

Zusammen ergibt sich daraus Daten ein quantitatives Maß für die in vivo-Wachstum und die Genexpression Dynamik der wachsenden Bakterien in den Tumoren.

Introduction

Synthetische Biologie hat sich in den letzten zehn Jahren Fortschritte gemacht und ist nun positioniert, um wichtige Probleme in den Bereichen Energie und Gesundheit auswirken. Allerdings hat die Expansion in den klinischen Bereich von Sicherheitsbedenken und einer Abwesenheit von der Entwicklung Design-Kriterien für in vivo genetische Schaltkreise verlangsamt worden. Beschleunigung hohe Schlagzähigkeit medizinische Anwendungen erfordern Methoden verwenden, die eine direkte Schnittstelle mit medizinischen Einrichtung Genetische Schaltkreise, die außerhalb des gesteuerten Testumgebung funktionieren, zu regeln und klinisch akzeptierten mikrobiellen Wirten.

Eine Reihe von Stämmen sind zur Krebstherapie aufgrund ihrer Fähigkeit, vorzugsweise wachsen in Tumoren untersucht. Diese haben C enthalten novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, und S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ist besonderem Interesse erzeugt, wie sie Sicherheit und Verträglichkeit in einer Reihe von klinischen Studien am Menschen haben gezeigt 9-12. Diese bacteri A wurden gezeigt, Anti-Tumor-Wirkung durch Stimulation des Immunsystems des Wirts und von Nährstoffmangel für Krebs Zellstoffwechsel erforderlich erstellen. Produktion von therapeutischen Ladung wurde später durch genetische Modifikationen aufgenommen. Während diese Studien wichtige Fortschritte bei der Verwendung von Bakterien für die Tumor-Therapien dar, die Mehrheit der bestehenden Bemühungen auf hoher Ebene Ausdruck, führt in der Regel die Lieferung von hohen Dosierungen, Off-Target-Effekte, und die Entwicklung von Host-Widerstand 13-16 berufen .

Jetzt können synthetische Biologie programmierbare Ladung Produktion durch den Einsatz rechnerisch ausgelegt genetischer Schaltkreise, die erweiterte Erfassung und Lieferung 17-20 durchführen hinzufügen können. Diese Schaltungen können entworfen, um als Delivery-Systeme, die Tumor-spezifische Stimuli und selbst regulieren Fracht Produktion notwendigen Sinn zu handeln. Allerdings hat die Untersuchung der Funktion dieser Schaltungen in vivo bisher schwierig gewesen.

ve_content "> Da Plasmide der gemeinsame Rahmen für synthetische Schaltungen sind, beschreiben wir eine Methode, um die Dynamik von Plasmid-basierte Genexpression in vivo mit einem Maus-Modell zu charakterisieren. Diese Methoden nutzen Zeitraffer Lumineszenz Bildgebung und quantitative Messung der Biodistribution. Gemeinsam Diese Ansätze bieten einen Rahmen für die Untersuchung Plasmid-basierte Netze in vivo für klinische Anwendungen.

Protocol

1. Zellpräparation Passage Zelllinien unter Verwendung von Standard-Zellkultur-Techniken. In diesem Experiment verwendeten wir OVCAR-8-Zellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Wachsen Zellen zu einem Ziel Konfluenz von 80 – 100%. Inkubieren Zellen mit 5 ml Trypsin für 5 min, dann 5 ml RPMI-Medium + FBS Trypsin zu inaktivieren. Ernte und Anzahl Zellen auf einer Zählkammer. Resuspendieren in Phenolrot-freiem DMEM auf ein Ziel Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml ode…

Representative Results

Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, Daten über die in vivo-Wachstum und Genexpression Dynamik der Tumor gezielt Bakterien erzeugen. Der gesamte Workflow wird in Abbildung 1 zusammengefasst. In der ersten Stufe injizieren wir Bakterien (grün) und Bild des Tieres mit IVIS die Genexpression mit Lumineszenz-(Blau) als Reporter zu messen. Dann, in der zweiten Stufe, wir Verbrauchssteuern, zu homogenisieren und die Platte für Tumoren…

Discussion

Mit diesem Verfahren sind wir in der Lage, Zeit-Verläufe für das Wachstum und die Genexpression Dynamik von Bakterien besiedeln Tumoren zu erzeugen. Während diese Messungen routinemäßig in vitro in Batch-Kultur oder Mikrofluidik-Geräte ausgeführt, sind sie viel schwieriger in vivo durchzuführen.

Es gibt verschiedene Modifikationen zu diesen Methoden angewendet werden können. Während wir die OVCAR-8-Zelllinie verwendet, um unsere Mausmodellen zu erzeugen, kann eine…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken H. Fleming für die kritische Durchsicht und Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoc-Stipendium Misrock (TD) und NDSEG Graduiertenstipendium (AP) unterstützt. SNB ist ein HHMI Investigator.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

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Cite This Article
Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

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