La stimulation mécanique induite par le calcium propagation des ondes dans des monocouches de cellules: l'exemple de bovins cellules endothéliales de la cornée

Summary

Ca intercellulaire^{2 +}-Ondes sont entraînés par des chaînes et hémicanaux de jonction gap. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer intercellulaire Ca^{2 +}-Ondes dans des monocouches de cellules en réponse à un stimulus mécanique seule cellule locale et son application à l'étude des propriétés et la régulation des canaux et hémicanaux de jonction gap.

Abstract

Communication intercellulaire est essentiel pour la coordination des processus physiologiques entre les cellules dans une variété d'organes et de tissus, y compris le cerveau, le foie, la rétine, la cochlée et le système vasculaire. Dans un cadre expérimental, intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} peut être obtenue en appliquant un stimulus mécanique à une seule cellule. Cela conduit à la libération des molécules de signalisation intracellulaire IP ₃ et Ca ^{2 +} qui initier la propagation de la Ca ^{2 +-onde} concentrique de la cellule stimulée mécaniquement les cellules voisines. Les principales voies moléculaires qui contrôlent intercellulaire Ca ^{2 +} propagation d'ondes sont fournis par des canaux des jonctions lacunaires par le transfert direct de IP ₃ et par hemichannels par la libération d'ATP. Identification et caractérisation des propriétés et la régulation des différents isoformes connexine et pannexine les canaux et les hémicanaux de jonction gap sont autorisés par le quantification de la propagation de la Ca ^{2 +} intracellulaire-ondes, siRNA, et l'utilisation d'inhibiteurs de canaux et hémicanaux de jonction gap. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} dans des monocouches de cellules endothéliales de la cornée primaires chargé de Fluo4-AM en réponse à un stimulus mécanique contrôlée et localisée provoquée par une déformation aiguë, de courte durée de la cellule à la suite toucher de la membrane de la cellule avec une micropipette de verre micromanipulateur contrôlé avec un diamètre de pointe de moins de 1 um. Nous décrivons également l'isolement des cellules endothéliales de la cornée bovine primaire et son utilisation comme système modèle pour évaluer l'activité Cx43-hemichannel comme la force entraîné pour intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} à travers la libération de l'ATP. Enfin, nous discutons de l'utilisation, les avantages, les limites et les variantes de cette méthode dans le cadre du canal de jonction d'espace et la recherche de hemichannel.

Introduction

Communication intercellulaire et la signalisation sont essentiels pour la coordination des processus physiologiques en réponse à des agonistes extracellulaires au niveau du tissu et de ^1,2 niveau entier organe. La façon la plus directe de la communication intercellulaire est créée par la présence de jonctions. Les jonctions lacunaires sont des plaques de canaux de jonctions lacunaires, qui sont des chaînes protéiques formés par l'accueil en tête-à-tête de deux (Cx) hemichannels connexine de cellules adjacentes ^3,4 (figure 1). Les jonctions lacunaires permettent le passage de petites molécules de signalisation avec un poids moléculaire de moins de 1,5 kDa, notamment ^{Ca2 +} ou IP ₃ ^5, ce qui provoque et de modulation du Ca ^{2 +} de la libération des réserves intracellulaires des cellules voisines ⁶ (figure 2). canaux des jonctions lacunaires sont strictement réglementées par les interactions entre protéines intra-et intermoléculaires et par des processus de signalisation cellulaire, comme la modification redox etphosphorylation ^7. GJ faciliter la réponse coordonnée de cellules connectées, agissant ainsi comme un syncytium chimique et électrique. Par exemple, la propagation du potentiel d'action cardiaque dans les myocytes auriculaires et ventriculaires est médiée par des canaux GJ Cx à base ^85. Cx ont non seulement un rôle de canaux de jonctions lacunaires, mais aussi former hemichannels non appariés, fonctionnant ainsi comme des canaux dans les membranes de même pour les canaux ioniques réguliers ^8-10 (Figure 1). Hémicanaux participent à la signalisation paracrines entre cellules voisines en contrôlant l'échange d'ions et molécules de signalisation entre l'environnement intra-et extracellulaire.

Dans de nombreux types de cellules (comme les cellules épithéliales, les cellules ostéoblastiques, les astrocytes, cellules endothéliales, etc) et des organes (comme le cerveau, le foie, la rétine, la cochlée et le système vasculaire), intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} sont fondamentales pour la coordination des réponses multicellulaires <sup> 11. L'augmentation des niveaux ^{2 +} intracellulaire de Ca dans une certaine cellule ne sont pas limités à cette cellule, mais se propagent aux cellules voisines environnantes, établissant ainsi un intercellulaire Ca ^{2 +-ondes 12,13.} Ces intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} sont importants pour la régulation physiologique normal de couches de cellules comme un syncytium et leur dérégulation a été associée à des processus physiopathologiques ^11. Dans l'endothélium cornéen et l'épithélium, les différents groupes ^14-24, y compris notre propre ^25-33, a étudié les mécanismes et les rôles de la communication intercellulaire. Dans les cellules non-excitables, comme les cellules endothéliales de la cornée, deux modes distincts de communication intercellulaire surviennent ^28,29, à savoir écart de jonction communication intercellulaire et de la communication intercellulaire paracrine. La communication intercellulaire par jonction implique un échange direct de molécules de signalisation via les jonctions gap ^7. Gap jonctioncommunication intercellulaire internationale est essentielle pour le maintien de l'homéostasie tissulaire, contrôle de la prolifération cellulaire, et d'établir une réponse synchronisée au stress extracellulaire ^10,34,35. Dans un certain nombre de pathologies, l'écart couplage de jonction est réduite en raison de Cx défectueux, et affectant la présente écart de jonction communication intercellulaire ^36. Ceci souligne l'importance et l'influence de la communication intercellulaire par jonction dans les organismes multicellulaires. Contrairement à la communication intercellulaire par jonction, la communication intercellulaire paracrine ne dépend pas de l'apposition de cellule à cellule, car elle implique la libération de messagers extracellulaires diffusables (Figure 2). Différents types de molécules de signalisation sont libérés dans l'espace extracellulaire par les cellules de signalisation. La molécule est alors transporté vers la cellule cible, où elle est détectée par une protéine réceptrice spécifique. Par la suite le complexe du signal du récepteur induit une réponse cellulaire, quiil est mis fin par le retrait du signal, l'inactivation ou une désensibilisation. Lipophiles messagers extracellulaires de signalisation Sortie pénétrer la membrane et agissent sur des récepteurs intracellulaires. En revanche, les messagers hydrophiles ne traversent pas la membrane plasmique de la cellule de réponse, mais agissent comme un ligand qui se lie à-exprimés surface des protéines réceptrices, qui ensuite transmettent le signal vers le milieu intracellulaire. Trois grandes familles de protéines réceptrices de surface cellulaire participent à ce processus: canal ionique lié, lié à une enzyme et la protéine G liés. La molécule de messager libéré peut agir sur les récepteurs de la même cellule (autocrine), sur des cellules cibles à proximité (paracrine), ou sur les cellules cibles lointaines qui nécessitent le système circulatoire (endocrine).

Dans de nombreux types de cellules, y compris endothélium cornéen ^28,29, l'ATP est l'un des principaux facteurs hydrophiles, paracrines qui stimulent la propagation des intercellulaire Ca ^{2 +-ondes 37-40.} DurING déformation mécanique, l'hypoxie, l'inflammation ou de la stimulation par divers agents, ATP peuvent être libérés à partir de cellules saines ^41-44 en réponse à la contrainte de cisaillement, étirement, ou gonflement osmotique ^44,45. Différents mécanismes ATP à libération prolongée ont été avancées, y compris l'exocytose vésiculaire ⁴⁴ et une pléthore de mécanismes de transport, tels que les cassettes (ABC) transporteurs de liaison ATP, canaux anioniques voltage-dépendants plasmiques ^46, P2X7 canaux récepteurs ^47,48, ainsi que connexine hemichannels ^49-52 et pannexine hémicanaux ^43,49,53. ATP extracellulaire peut être rapidement hydrolysé à l'ADP, l'AMP et l'adénosine ^54,55 par ectonucléotidases qui sont présents dans le milieu extracellulaire. L'ATP extracellulaire libéré et son métabolite ADP ⁵⁶ se propage par diffusion. L'interaction ultérieure de ces nucléotides avec des récepteurs purinergiques dans les cellules voisines a été impliquée dans la propagation de intercellulaire Ca ^{2 +-ondes 28,37,51.} Deux classes différentes de récepteurs purinergiques sont présents: l'adénosine est le principal ligand naturel pour P1-purinorécepteurs, alors que les deux purine (ATP, ADP) et pyrimidiques (UTP, UDP) nucléotides agissent sur ​​la plupart P2-purinorécepteurs ^57.

Communication intercellulaire peut être étudiée par différentes méthodes telles que gratter chargement, transfert de colorant, uncaging locale d'agonistes comme _IP3 et Ca ^{2 +,} la stimulation mécanique, etc. Nous décrivons ici l'étude de Ca ^{2 +} propagation d'onde provoquée par une stimulation mécanique d'une seule cellule. L'avantage d'étudier Ca ^{2 +} propagation d'ondes par une stimulation mécanique est qu'il fournit un outil facile à quantifier la propagation de la Ca ^{2 +-onde} au fil du temps et il permet de comparer quantitativement différents prétraitements des cellules. Dans l'endothélium cornéen, les intercellulaire Ca ^{2 +-ondes} permettent une coréponse coordonnée à partir de la monocouche, agissant par les présentes en tant que mécanisme de défense possible de l'endothélium cornéen non régénératif aider l'endothélium pour résister aux contraintes extracellulaire lors de la chirurgie intra-oculaire, ou par exposition à des médiateurs inflammatoires pendant rejet immunitaire ou uvéite ^58,59.

Protocol

1. Isolement des cellules endothéliales de la cornée Avant de commencer: isoler les cellules des yeux neufs, provenant d'un abattoir local, dès que possible après énucléation de l'œil. Assurez-vous que l'œil a été énucléé d'une vache du maximales de 18 mois, à cinq minutes post mortem et conservées dans une solution saline équilibrée de Earle – solution d'iode de 1% à 4 ° C pour le transport au laboratoire. Prenez l'œil de la solution sa…

Representative Results

Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation et le protocole en démonstration est effectuée sous la direction et l'approbation du soin des animaux et le comité de l'utilisation de la KU Leuven. Dans les cellules endothéliales de la cornée bovine (BCEC), les jonctions fonctionnels sont exprimés et à la fois espace de jonction communication intercellulaire et de la communication intercell…

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple pour mesurer intercellulaire Ca ^{2 +} propagation d'ondes dans des monocouches de cellules endothéliales de la cornée bovine primaire en fournissant une stimulation mécanique localisée et contrôlée à l'aide d'une micropipette. Cellules stimulées mécaniquement réagissent avec une augmentation locale IP intracellulaire ₃ et Ca ^{2 +,} qui sont tous deux molécules de signalisation intracellulaires essentielles qui anim…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller