Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.
Orofasiyal yarıkların 1000 bebekten dünya çapında 1,2 1,5 etkileyen en sık kraniofasiyal defektlerin vardır. Orofasiyal yarıklaşmanın anormal yüz gelişme 3 neden olur. Yüz insan ve fare, ilk büyüme ve desenlendirme içindeki doku birkaç küçük tomurcukları, 4,5 yüz çıkıntıları dayanır. Eşleştirilmiş frontal burun süreçler (FNP), maksiller çıkıntıların (MXP) ve mandibular çıkıntıların (MdP): yüz altı ana çıkıntıların türetilmiştir. Bu çıkıntılar bir örten epitel kaplı bulunmaktadır mezenşimi ve şişlikler oluşur. Birden fazla tür çalışmalar yüz ektoderm ve mezenşimi arasındaki karışma sinyal yüzünü 6 şekillendirme için kritik olduğunu göstermiştir. Ancak, bu sinyal röleleri Genlerdeki ilgili mekanistik ayrıntıları eksiktir. Bir gen ekspresyonu kapsamlı bir anlayış kazanmak için bir yol, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve develo ile ilişkili kromatin işaretleriping yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılmış doku kompartmanları izole ve karakterize etmektir.
Burada embriyonik gün (E) 10.5, çıkıntıların füzyon öncesinde fare yüz oluşumunda kritik bir gelişimsel aşamada yüz ektoderm ve mezenşimi ayırmak için bir yöntem mevcut. Bizim yöntemi daha önce yüz çıkıntıları 7 diseksiyon için kullanmış yaklaşımı uyarlanmıştır. Bu önceki çalışmada kendilenmiş C57BL istihdam vardı / Bu zorlanma gibi 6 farelerin genetik, genomik ve yüz morfolojisi 8 için bir standart haline gelmiştir. Burada, buna rağmen, uygun bir doku daha sınırlı miktarlarda nedeniyle, biz hayvancılık için, daha sağlam satın almak daha ucuzdur outbred CD-1 suşu kullanılmıştır ve herhangi kendilenmiş daha çöp başına daha fazla embriyo (12-18) üretmek eğilimi var fare zorlanma 8. Embriyo izolasyon takiben, nötr proteaz dispase II bütün embriyo tedavi etmek için kullanılmıştır. Sonra, yüz çıkıntıları teşrih edildied dışarı ve yüz ektodermden mezenşimi ayrıldı. Bu yöntem, yüz ektoderm ve mezenşim her ikisi de bozulmadan muhafaza eder. Bu yöntemi kullanarak elde edilen örneklerin protein tespiti, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tayini, mikroarray çalışmalar ve RNA-seq dahil teknikleri kullanılabilir.
Bu protokol, bir ilk dispase II işlenme adımını esas fare embriyonik yüz ektoderm ve mezenşim ayırmak için basit bir yöntem sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, önceden dispase II tedavi yüz çıkıntıları diseksiyonu uygulandı, ama biz sürekli mezenşimi "yapışkan" ve işlemek için daha zor hale gelmesidir bulduk. Bizim yeni protokol bu sorunu önler. Kombinasyon dispase II aşağı yukarı pipetleme ve tarafından nazik fiziksel gücü ile tedavi ektoderm ve kolay mezenşimi ayrı…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Şekil 1 ve yardım ve tartışma için laboratuvarın diğer üyeleri embriyonun kafaları göstermek için Irene Choi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe DE012728 (TW) tarafından desteklenmektedir
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |