分离的小鼠胚胎面外胚层和间充质
Summary
外胚层和间充质细胞的胚胎面部分离的协议。我们使用的是中性蛋白酶II对待整个胚胎首先，剖析整个面部突起，然后分离的面部外胚层和间充质细胞。
Abstract
口面裂是最常见的颅面畸形，从而影响1.5在1000新生儿全球1,2。颜面部clefting引起的脸部发育异常3。在人类和小鼠中，最初的增长和图案的脸依赖于几个小芽组织，面部突起4,5。面对来自6个主要的日珥：配对正面的鼻流程（FNP），上颌骨突起（MXP）和下颌骨突起（MDP）。这些日珥包括装在覆上皮细胞肿胀，间质细胞，。在多个物种的研究表明，信号之间的串扰面部外胚层和间充质是至关重要的塑造脸部6。然而，机械的细节关于这些信号继电器中所涉及的基因所缺乏的。的方式来获得一个全面的了解基因表达的转录因子结合，及相关的染色质标记的开发与平面外胚层和间充质细胞的分离和鉴定分离的组织车厢。
在这里，我们提出了一个方法，分离面外胚层和间充质细胞在胚胎天（E）10.5鼠标的面部的形成，融合的日珥之前，一个关键的发展阶段。我们的方法是适用的方法，我们以前用于解剖面部突起7。在这个早期的研究中，我们采用近交系C57BL / 6小鼠作为这株已成为标准的遗传学，基因组学和面部形态。在这里，虽然，由于可用组织更有限的数量，我们已利用远交的CD-1菌株，购买更便宜，更健壮的畜牧业，并趋向于产生更多的胚胎（12-18）比任何自交系每窝小鼠品系8。在胚胎隔离，中性蛋白酶中性蛋白酶用于治疗II全胚胎。然后，面部突起剖析编出来，面部外胚层分离的间充质细胞。这种方法保持完整的面部外胚层和间质。可用于蛋白质检测，染色质免疫沉淀法（ChIP）的检测，基因芯片的研究，和RNA-seq的技术，包括使用这种方法获得的样品。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议提供了一个简单的方法来分离面部小鼠胚胎外胚层和间充质的基础上Dispase酶II的初步处理步骤。在以前的研究中，我们进行了解剖的面部突起之前，中性蛋白酶II处理，但我们一直发现，间充质变成“粘”，更难以操纵。我们的新的协议，避免了这个问题。结合中性蛋白酶II处理与柔和的身体的力量，通过上下吹打分离的外胚层和间充质更容易。此外，该协议还可以很好地用于分离的胚胎外…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢艾琳在图1和实验室的其他成员的帮助和讨论，说明胚胎头彩。这项工作是由美国国立卫生研究院授予DE012728（TW）
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
