Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima
Summary
Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.
Abstract
Fendas orofaciais são os defeitos mais freqüentes craniofaciais, que afetam 1,5 em 1000 1,2 recém-nascidos em todo o mundo. Fissuras orofaciais é causada por três desenvolvimento anormal facial. No ser humano e do rato, o crescimento inicial e padronização da cara depende de várias papilas pequenas de tecido, as proeminências faciais 4,5. O rosto é derivado de seis principais destaques: emparelhados processos frontais nasais (FNP), proeminências maxilares (MXP) e proeminências mandibulares (MDP). Estes consistem de proeminências inchaços de mesênquima que estão incorporados em um epitélio de revestimento. Estudos realizados em várias espécies têm mostrado que a sinalização crosstalk entre ectoderma facial e mesênquima é crítico para a formação da face 6. No entanto, os detalhes mecanísticos sobre os genes envolvidos nestes relés de sinalização são escassos. Uma maneira de obter uma compreensão abrangente da expressão do gene, fator de transcrição de ligação, e marcas de cromatina associados ao desenectoderme pingue facial e mesênquima é isolar e caracterizar os compartimentos dos tecidos separados.
Aqui apresentamos um método para separar ectoderma facial e mesênquima no dia embrionário (E) 10,5, uma fase crítica de desenvolvimento na formação do mouse facial que precede a fusão dos destaques. O nosso método é adaptado a partir do método já anteriormente utilizado para dissecar proeminências faciais 7. Neste estudo anterior havia sido empregado C57BL inato / 6 ratos como esta cepa se tornou um padrão para a genética, morfologia facial genômica e 8. Aqui, no entanto, devido às quantidades mais limitadas de tecido disponível, nós utilizamos a estirpe CD-1 outbred que é mais barata para comprar, mais robusto para a criação, e que tende a produzir mais embriões (12-18) por ninhada do que qualquer inbred rato tensão 8. Seguindo o isolamento do embrião, neutro protease Dispase II foi usada para tratar o embrião inteiro. Em seguida, as proeminências faciais foram dissecared para fora, e a ectoderme facial foi separado do mesênquima. Este método mantém tanto ectoderme facial e mesênquima intacta. As amostras obtidas utilizando este método pode ser usado para a detecção de proteínas, incluindo as técnicas, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio, os estudos de microarranjos e RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um método simples para separar ectoderma rato embrionário mesênquima facial e base em uma primeira etapa de tratamento Dispase II. Em estudos anteriores, temos realizado dissecção das proeminências faciais antes Dispase tratamento II, mas temos de forma consistente que o mesênquima se torna "pegajoso" e mais difícil de manipular. Nosso novo protocolo evita esse problema. Combinação Dispase II tratamento com força física suave pipetando para cima e para baixo faz a separação…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Irene Choi para ilustrar cabeças de embriões em Fig. 1 e os outros membros do laboratório de ajuda e discussão. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
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